一応丹羽さんと清成さんは１１５４個の胚移植を行って３７１個の発生を
確認したが、キメラ貢献は一つも無かったと報告しているんだね。
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Among 1154 embryos injected with the aggregates, 671 developed beyond E8.5;
however, none of the aggregates made significant contribution to any tissues,
the details of which was reported in a Biorixiv website (bioRxiv doi:
*ttp://dx.doi.org/10.1101/028472).
丹羽論文Figure3-aだね。ESはOct4蛋白質の発現量に完全比例してOct4-GFPが発現している。
ところがnon-treatもATPもHCLもOct4蛋白質が全く発現していないのにOct4-GFPが発現している。
この原因は細胞を解離すした時の荒っぽいやり方が原因だということにならざるを得ないね。
丹羽さんはこの発見に関して、Interestinglyと書きだしているが、そんな安易な発見でなかったことには
今頃はお気づきなのかもしれないね。
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Interestingly, expression of Gfp from the Oct3/4-GFP transgene (GOF18)14 was detected in liver cells cultured for seven days irrespective of ATP treatment, suggesting leaky expression of this transgene.
Induced cell aggregates show poor induction of pluripotency-associated markers
To test the induction of pluripotency markers in cell aggregates obtained from ATP-treated liver cells, we assessed the expression of pluripotency-associated genes. Oct3/4 is a well-defined marker of pluripotent stem cells. Using a primer pair to detect Oct3/4 transcript from the Pou5f1 allele, but not pseudo-genes[13], we did not find a detectable level (above 0.1% of the expression level in mouse ES cells, relative to the expression levels of Gapdh) of the transcript by quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) using a total RNA sample prepared from all cells in the culture (Fig. 3a), indicating that extremely few or no cells expressing Oct3/4 were present. Interestingly, expression of Gfp from the Oct3/4-GFP transgene (GOF18)「14 」was detected in liver cells cultured for seven days irrespective of ATP treatment, suggesting leaky expression of this transgene.
(英文)
Figure 3: Q-PCR analysis for the expression of pluripotency markers in induced cell aggregates.
Figure 3
(a) Q-PCR analysis of the low-pH treated liver cells cultured for 7 days. Liver cells were prepared from 7-day old GOF mice and treated with either ATP or HCl, or without stressor. RNA samples were prepared from all cells in the wells at day 7 of culture and the relative expression levels of Gfp (derived from GOF Tg) and Oct3/4 (derived from the endogenous Pou5f1 allele) to Gapdh were indicated with standard deviation. The expression levels in control ES cells carrying CAG-GFP Tg were set at 1.0. (b) Q-PCR analysis of the single cell aggregates derived from the ATP-treated or non-treated liver cells cultured for seven days. The liver cells were prepared from 4-days old of C57BL6/129 mice and the single cell aggregates were separately treated for quantification of gene expression. The relative expression levels of pluripotency-associated genes to Gnb2l1 were indicated with standard deviation. The expression levels in 10 control ES cells were set at 1.0. (c) Frequency of cell aggregates showing the levels of Oct3/4 expression comparable to ES cells. The relative expression levels of Oct3/4 in single cell aggregates derived from liver cells were measured as b and the frequency of the cell aggregates with the levels of Oct3/4 expression over 0.001 of relative expression to ES cells is indicated.
で、問題は仮に小保方さんの発見したOct4蛋白発現細胞が多能性細胞であったとしたら、
それはES細胞と同じなのですから１個でも入るとキメラになる確率が高い。となると
３万個に１２個でもいいからどれだけ数をこなしたらそれにあたるかということになりますね。
そこで３万個に12個というのは2500個に１個だねという計算ができますよね。ナイフ切り分けで
できたと書かれているのでその数を仮に写真でみらけめように２０個程度としたら125個の
キメラ胚を作ったらそのうちの１個が当たるという計算になる。それを丹羽さん達は1154個の
キメラ胚を作って確かめたんです。８．５日胚まで発生したのは671個でしたが、どこにもキメラ貢献
事実は無かったと報告した。確率的にはうまくいけば125回に一回当たるものを671回やってみたが
一つも当たらなかったということです。６回振れば１回１の目が出る確率のサイコロを３０回振ってみたが
１の目が出なかったということです。１００回振ったらその後１６回続けて１の目が出たかもしれない。
そもそも１の目の無いダイスだったのか。そこは分かりませんよね。
however, none of the aggregates made significant contribution to any tissues,
関連個所は貼っときましょう。
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Figure 5: アnalyses of fluorescent signals from GOF transgene.
Figure 5
(a) Fluorescent microscopic アnalysis of cell aggregates derived from GOF Tg mice. The cell aggregates (top) were derived from liver cells of 6-days old of GOF Tg mice. Fluorescent images with the filter sets for detection of GFP and RFP signals are shown. Images of ES cells carrying CAG-GFP (middle) captured with the same conditions are shown as a control to confirm no leaky signal of GFP in RFP channel. Images of wild-type ES cells (bottom) are shown as a control to confirm spesific signal of GFP in GFP channel. (b) FACS analysis of the low-pH treated spleen cells derived from GOF Tg mice. The spleen cells were isolated from 7-day-old GOF Tg mice and prepared with Lympholyte followed by treatment with the indicated stressors. After the culture for seven days, the cells were dissociated, stained with anti-E-cadherin with PE and anti-CD45 with APC, and analyzed by FACS. Wild-type ES cells were used as a positive control for E-cadherin staining and a negative control for CD45-staining as well as GFP fluorescence.
それは書き込み者の補足という言葉に拘泥するからでしょ。補足と言ったのは書き込み者なのであって
丹羽さんではない。丹羽さんがこのコントロールをどういう意味で置いたのかと考えるだけでいいでしょ。
Figure5は自家蛍光と区別するために赤色フィルターを使っている。aは酸浴スフィア塊で、緑と赤の両方で
蛍光が確認されているから自家蛍光だと判断されている。そしてbはCAG-GFPの
ES細胞で、緑だけで赤には蛍光していない。でもこれはOct4-GFPではないよね。だからOct4が発現している
多能性細胞で自家蛍光ではないと言ったところで意味のないコントロールだね。更にCはGFPの無いESだ。
これはどちらの蛍光もないという当たり前の結果だ。で、この時に使われたCAG-GFPのコントロールの意味合いが
ちゃんと書かれていて、それはGFPの漏れ出しが無いという証拠にしている。
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Images of ES cells carrying CAG-GFP (middle) captured with the same conditions are shown as a control to confirm no leaky signal of GFP in RFP channel.
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On observation with fluorescent microscopy, most aggregates showed both green and red fluorescence, a sign of auto-fluorescence (Fig. 5a) although this may also include the fluorescent signal from the GOF transgene, since we detected Gfp mRNA by qPCR in these cells after culture in vitro for seven days (Fig. 3a).
< 蛍光顕微鏡で観察したところ、ほとんどの凝集塊は緑色蛍光と赤色蛍光の両方を示したが(Fig. 5a)、我々は7日間試験管内培養後のこれらの細胞において、qPCRによりGfp mRNAを検出したので、GOF挿入遺伝子由来の蛍光シグナルも含まれているかもしれない。>
丹羽さんは５０万個の細胞から30個のスフィア塊を得たとしているんだけど
ティシュー論文には
The number of spheres formed was 116±5(n=5) per 10 million cells initially plated.
<成されたスフィアの数は、最初蒔種された1000万個の細胞あたり116±5（n = 5）であった。 >
と書かれているわね。これって50万個に置き換えると６個弱ね。丹羽さんの３０個って
小保方さんの５倍だわ。小保方さんより上手なのね。ふふふ。
まあ、科学的事実解明の検討は後にしよう。小保方さんや他の人もその時点で
思い込んでいることを前提にしてその記述が捏造不正で歩かないかを問わないといけない。
gが例の問題となったゲル写真だよね。石川調査で結局は何の実質的不正も無かったもので、
ただ単に白線を入れるというルールを知らなかっただけの話だったね。
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g, Genomic PCR analysis of (D)J recombination at the Tcrb gene of T-cell-derived STAP cells. G.L. is the size of the non-rearranged germline type, whereas the smaller ladders correspond to the alternative rearrangements of J exons (confirmed by sequencing). Negative controls (ES cells), positive controls (lymphocytes) and T-cell-derived STAP (two independent preparations on d7) are indicated.
丹保さんのこれに該当するコントロールESのGFPはCAGだったよね。小保方さんは
ただGOFマウスからスフィア塊を作るだけしか許されてなかった。
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The gene expression analysis results were taken from each cluster in the upper panels. The ID numbers (such as ATP-No.1) in the photos and in the gene expression profile are identical. For example, the gene expression results from ATP-No.1 was obtained from the cell cluster of ATP-No.1 in the photo panel.
The cell culture was performed by Haruko Obokata. Photography and gene expression analyses were performed by other members in the STAP verification experiment team.
