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(資料)対訳レター論文

1 ふむ :2018/10/10(水) 10:42:22
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54 司書 :2018/10/10(水) 11:26:10
(英文)
Inhibitor assay
For JAK inhibitor assay, Fgf4-induced stem cells were cultured without feeders for 48 h in trophoblast stem-cell culture medium supplemented with 0.6 μM JAK inhibitor (CalBiochem, 420097). As a control, ES cells were also cultured for 48 h in ES medium supplemented with 0.6 μM JAK inhibitor. After the JAK inhibitor treatment, cells were collected and their gene expression was analysed by RT–PCR. For MEK inhibitor assay, dissociated Fgf4-induced stem cells were plated in either LIF containing ES medium supplemented with 1 μM MEK inhibitor (PD025901) or FGF4 containing trophoblast stem cell medium supplemented with 1 μM MEK inhibitor for 48 h. As controls, dissociated Fgf4-induced stem cells were co-plated with 5% or 50% of ES cells into the same culture conditions. After the MEK inhibitor treatment, colonies that formed in each culture condition were counted.

55 翻訳機 :2018/10/10(水) 11:26:51
阻害剤実験
JAK阻害剤実験のために、0.6μMのJAK阻害剤(CalBiochem、420097)を補充した栄養膜幹細胞培養培地中でFgf4誘導幹細胞をフィーダーなしで48時間培養した。 コントロールとして、ES細胞を0.6μMのJAK阻害剤を補充したES培地で48時間培養した。 JAK阻害剤処理の後、細胞を収集し、それらの遺伝子発現をRT-PCRによって分析した。 MEK阻害剤アッセイのために、解離したFgf4誘発幹細胞を1μMのMEK阻害剤(PD025901)を補充したLIF含有ES培地、または1μMのMEK阻害剤を補充した栄養膜幹細胞培地を含むFGF4培地に48時間播種した。コントロールとして、解離したFgf4誘導性幹細胞を、5%または50%のES細胞と共培養した。 MEK阻害剤処理後、各培養条件で形成されたコロニーを数えた。

56 司書 :2018/10/10(水) 11:28:02
(英文)
FACS sorting
Fgf4-induced stem cells were dissociated into single cells and were suspended in 0.5% BSA PBS. Suspended cells were Fc-blocked by treatment with 1 μg of mouse IgG per 10(to yhe power of 5) cells for 15 min at room temperature. PE-conjugated integrin α7 antibody (R&D system, FAB3518P, dilution at 1:10) was added into cell suspension, and cells were incubated for 30 min on ice. Finally, cells were rinsed with PBS three times and propidium iodide was added for dead cell elimination. As a control, Fgf4-induced stem cells in a separate tube were treated with PE-labelled rat IgG2B antibody. Integrin α7-positive and -dim cells were sorted by FACS aria II (BD).

57 翻訳機 :2018/10/10(水) 11:28:42
FACSソーティング
Fgf4誘導幹細胞を単細胞に解離させ、0.5%BSA PBSに懸濁させた。 懸濁した細胞を、室温で15分間、10の5乗細胞あたり1μgのマウスIgGで処理することによってFc-遮断した。PE結合インテグリンα7抗体(R&Dシステム、FAB3518P、1:10希釈)を細胞懸濁液に加え、細胞を氷上で30分間インキュベートした。 最後に、細胞をPBSで3回すすぎ、死細胞除去のためにヨウ化プロピジウムを添加した。 コントロールとして、別のチューブ中のFgf4誘導幹細胞をPE標識ラットIgG2B抗体で処理した。 インテグリンα7陽性および 弱発現細胞をFACS aria II(BD)で選別した。

58 司書 :2018/10/10(水) 11:30:02
(英文)
RNA sequencing and ChIP sequencing analyses
RNA-sequencing of cell lines was performed with biological duplicate samples. Total RNA was extracted from T cells by the RNasy mini kit (Qiagen). RNA-seq libraries were prepared from 1 μg total RNAs following the protocol of the TruSeq RNA Sample Prep kit (Illumina) and subjected to the deep sequencing analysis with Illumina Hi-Seq1000. A cluster tree diagram of various cell types was obtained from hierarchical clustering of global expression profiles (log2 FPKM of all transcripts; FPKM, fragments per kilobase of transcript per million mapped reads). Complete linkage method applied to 1 − r (r = Pearson’s correlation between profiles) was used for generating the tree and 1,000 cycles of bootstrap resampling were carried out to obtain statistical confidence score in % units (also called AU P values). For the analysis that included morula and blastocyst embryos (only small amounts of RNA can be obtained from them), we used pre-amplification with the SMARTer Ultra Low RNA kit for Illumina Sequencing (Clontech Laboratories). Differentially expressed genes were identified by the DESeq package23.

59 翻訳機 :2018/10/10(水) 11:31:22
RNAシークエンシングおよびChIPシークエンシング解析
生物学的二重試料を用いて細胞系のRNA配列決定を行った。全RNAをRNasyミニキット(Qiagen)によりT細胞から抽出した。 RNA-seqライブラリーは、TruSeq RNA Sample Prepキット(イルミナ)のプロトコールに従って1μgの全RNAから調製し、Illumina Hi-Seq1000で深い配列決定分析を行った。全発現プロファイルの(全転写物のlog2 FPKM; FPKMは、マップされた百万リードに対して、転写物のキロベースあたりの断片数を意味する)階層的クラスタリングから、様々な細胞型のクラスターツリー図を得た。ツリーを作成するために、1-r(r=プロファイル間のピアソン相関係数)に適用された完全リンケージ法を使用し、%単位(AU P値とも呼ばれる)で統計的信頼スコアを得るために1,000サイクルのブートストラップ再サンプリングを実施した。桑実胚および胚盤胞胚を含む分析(少量のRNAしか得られない)に関しては、Illumina Sequencing(Clontech Laboratories)用のSMARTer Ultra Low RNAキットで事前増幅を行った。異様発現遺伝子は、DESeqパッケージ23によって同定された。

60 司書 :2018/10/10(水) 11:32:22
(英文)
ChIP-seq libraries were prepared from 20 ng input DNAs, 1 ng H3K4me3 ChIP DNAs, or 5 ng H3K27me3 ChIP DNAs using the KAPA Library Preparation kit (KAPA Biosystems). TruSeq adaptors were prepared in-house by annealing a TruSeq universal oligonucleotide and each of index oligonucleotides (5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′, and 5′-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3′; where X represents index sequences).
Chromatin immunoprecipitation was performed as follows. Cells were fixed in PBS(-) containing 1% formaldehyde for 10 min at room temperature. Glycine was added to a final concentration of 0.25 M to stop the fixation. After washing the cells twice in ice-cold PBS(-), cells were further washed in LB1 (50 mM HEPES-KOH pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% NP-40, 0.25% Triton X-100) and LB2 (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA). Cells were then re-suspended in lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS). Lysates were prepared by sonication using COVARIS S220 in a mini tube at duty cycle = 5%, PIP = 70, cycles per burst = 200, and the treatment time of 20 min. Lysates from 2 × 106 cells were diluted in ChIP dilution buffer (16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1% Triton X-100, 0.01% SDS). ChIP was performed using sheep anti-mouse IgG beads (Invitrogen) or protein A beads (Invitrogen) coupled with anti-histone H3K4me3 antibody (Wako, catalogue no. 307-34813) or anti-histone H3K27me3 antibody (CST, catalogue no. 9733), respectively.

61 翻訳機 :2018/10/10(水) 11:33:05
ChIP-seqライブラリーを、20ngの入力DNA、1ngのH3K4me3 ChIP DNA、または5ngのH3K27me3 ChIP DNAから、KAPAライブラリー調製キット(KAPA Biosystems)を用いて調製した。 TruSeqアダプターは、TruSeqユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび各インデックスオリゴヌクレオチド(5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGCGCTCTTCCGATCT-3 'および5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3';ここで、Xはインデックス配列を表す)のアニーリングによって社内で調製した。
クロマチン免疫沈降は以下のように行った。細胞を1%ホルムアルデヒドを含むPBS( - )中で室温で10分間固定した。グリシンを最終濃度0.25Mになるように加えて固定を停止させた。氷冷PBS( - )で細胞を2回洗浄した後、LB1(50mM HEPES-KOH pH7.5,140mM NaCl、1mM EDTA、10%グリセロール、0.5%NP-40,0.25%Triton X-100)およびLB2(10mMトリス-HCl pH8.0,200mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA)で洗浄した。次いで、細胞を溶解緩衝液(50mMトリス-HCl pH8.0,10mM EDTA、1%SDS)に再懸濁した。溶解物は、デューティーサイクル= 5%、PIP = 70、バースト当たりのサイクル= 200、および20分の処理時間でミニチューブ中でCOVARIS S220を使用する超音波処理によって調製した。 2×10 の6乗細胞からの溶解物をChIP希釈緩衝液(16.7mMトリス-HCl pH8.0,167mM NaCl、1.2mM EDTA、1.1%Triton X-100,0.01%SDS)で希釈した。 ChIPは、抗ヒストンH3K4me3抗体(Wako、カタログ番号307-34813)または抗ヒストンH3K27me3抗体(CST、カタログ番号9733)と結合したヒツジ抗マウスIgGビーズ(Invitrogen)またはプロテインAビーズ(Invitrogen) )を使って実施された。

62 司書 :2018/10/10(水) 11:33:45
(英文)
After 4–6 h of incubation in a rotator at 4 °C, beads were washed five times in low-salt wash buffer (20 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% SDS), and three times in high-salt wash buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% SDS). Target chromatin was eluted off the beads in elution buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% SDS) at room temperature for 20 min. Crosslink was reversed at 65 °C, and then samples were treated with RNaseA and proteinase K. The prepared DNA samples were purified by phenol-chloroform extraction followed by ethanol precipitation and dissolved in TE buffer.

63 翻訳機 :2018/10/10(水) 11:34:56
4℃で回転子中で4〜6時間保温した後、ビーズを低塩洗浄緩衝液(20mM Tris HCl pH8.0,150mM NaCl、2mM EDTA、1%Triton X-100,0.1 %SDS)で5度洗浄し、高塩洗浄緩衝液(20mM Tris-HCl pH8.0,500mM NaCl、2mM EDTA、1%Triton X-100,0.1%SDS)中で3度洗浄した。 溶出緩衝液(10mMトリス-HCl pH8.0,300mM NaCl、5mM EDTA、1%SDS)中、室温で20分間、標的クロマチンをビーズから溶出させた。 65℃で架橋を逆転させた後、サンプルをRNaseAおよびプロテイナーゼKで処理した。調製したDNAサンプルをフェノール - クロロホルム抽出および続いてエタノール沈殿により精製し、TE緩衝液に溶解した。

64 司書 :2018/10/10(水) 11:37:15
(英文)
References

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65 翻訳機 :2018/10/10(水) 11:38:41
参考文献

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66 司書 :2018/10/10(水) 11:40:31
(英文)
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67 翻訳機 :2018/10/10(水) 11:41:39
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9. Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. & Rossant, J. FGF4による栄養膜幹細胞増殖の促進。 Science 282, 2072–2075 (1998)
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68 司書 :2018/10/10(水) 11:44:31
(英文)
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13. Niwa, H. et al. Interaction between Oct3/4 and Cdx2 determines trophectoderm differentiation. Cell 123, 917–929 (2005)
14. Mikkelsen, T. S. et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature 454, 49–55 (2008)
15. van Oosten, A. L., Costa, Y., Smith, A. & Silva, J. C. JAK/STAT3 signalling is sufficient and dominant over antagonistic cues for the establishment of naive pluripotency. Nature Commun. 3, 817 (2012)
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69 翻訳機 :2018/10/10(水) 11:46:10
11. Klaffky, E. et al. 移植前後のマウス胚におけるインテグリンα7サブユニットの栄養膜特異的発現および機能。 Dev. Biol. 239, 161–175 (2001)
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14. Mikkelsen, T. S. et al.統合的ゲノム分析による直接再プログラミングの解明。 Nature 454, 49–55 (2008)
15. van Oosten, A. L., Costa, Y., Smith, A. & Silva, J. C.JAK / STAT3シグナル伝達は、原初多能性の確立に関する対立的開始合図を凌いで、十分であり、かつ圧倒的である。 Nature Commun. 3, 817 (2012)
16. Yang, J. et al. Stat3活性化は、基底多能性への再プログラミングを制限している。 Cell Stem Cell 7, 319–328 (2010)
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70 司書 :2018/10/10(水) 11:48:23
(英文)
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71 翻訳機 :2018/10/10(水) 11:49:57
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23. Anders, S. & Huber, W. 配列カウントデータのための特異的発現分析。 Genome Biol. 11, R106 (2010)

72 司書 :2018/10/10(水) 11:51:13
(英文)
Acknowledgements

We thank S. Nishikawa and N. Love for discussion and M. Ohgushi, S. Kuraku, M. Eiraku, S. Ohtsuka and K. Kakiguchi for help with experimental planning, material preparation and analyses. Financial support for this research was provided by Intramural RIKEN Research Budget (H.O., T.W. and Y.S.), a Scientific Research in Priority Areas (20062015) to T.W., the Network Project for Realization of Regenerative Medicine to Y.S., and Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine at Brigham and Women’s Hospital to C.A.V.

73 翻訳機 :2018/10/10(水) 11:51:54
謝辞

私たちは、討論に関してS. Nishikawa と N. Loveに、実験計画、材料の準備と分析の援助に関して、M. Ohgushi、S. Kuraku、M. Eiraku、S. Ohtsuka 及び K. Kakiguchiに謝意を表する。本研究の資金援助は、理研内の理研研究予算(小保方晴子、若山照彦、笹井芳樹)、若山輝彦への優先分野の科学研究(20062015)、笹井芳樹への再生医療の実現のためのネットワークプロジェクト、及びチャールズ・A・ヴァカンティへのブリガム・ウィミンズ病院麻酔部門術後処置と痛み治療科によって提供された。

74 司書 :2018/10/10(水) 11:54:32
(英文)
Author information

Affiliations
1. Laboratory for Cellular Reprogramming, RIKEN Center for Developmental Biology, Kobe 650-0047, Japan
Haruko Obokata &
Yukari Terashita

2. Laboratory for Genomic Reprogramming, RIKEN Center for Developmental Biology, Kobe 650-0047, Japan
Haruko Obokata,
Mikiko Tokoro,
Yukari Terashita &
Teruhiko Wakayama

75 翻訳機 :2018/10/10(水) 11:55:12
著者情報

所属
1.細胞リプログラミングのための研究室、理化学研究所発生生物学センター、神戸650-0047、日本
Haruko Obokata &
Yukari Terashita

2.ゲノムリプログラミングのための研究室、理化学研究所発生生物学センター、神戸650-0047、日本
Haruko Obokata,
Mikiko Tokoro,
Yukari Terashita &
Teruhiko Wakayama

76 司書 :2018/10/10(水) 11:56:07
(英文)
3. Laboratory for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA
Haruko Obokata &
Charles A. Vacanti

4. Laboratory for Organogenesis and Neurogenesis, RIKEN Center for Developmental Biology, Kobe 650-0047, Japan
Yoshiki Sasai &
Nozomu Takata

5. Laboratory for Pluripotent Stem Cell Studies, RIKEN Center for Developmental Biology, Kobe 650-0047, Japan
Hitoshi Niwa

77 翻訳機 :2018/10/10(水) 11:56:43
3.組織工学および再生医療のための研究室、ブリガム・ウィミンズ病院、ハーバード大学医学部、ボストン、マサチューセッツ州02115、米国
Haruko Obokata &
Charles A. Vacanti

4.器官形成および神経発生のための研究室、理化学研究所発生生物学センター、神戸650-0047、日本
Yoshiki Sasai &
Nozomu Takata

5.多能性幹細胞学のための研究室、理化学研究所発生生物学センター、神戸650-0047、日本
Hitoshi Niwa

78 司書 :2018/10/10(水) 11:58:41
(英文)
6. Genome Resource and アnalysis Unit, RIKEN Center for Developmental Biology, Kobe 650-0047, Japan
Mitsutaka Kadota &
Munazah Andrabi

7. Electron Microscopy Laboratory, RIKEN Center for Developmental Biology, Kobe 650-0047, Japan
Shigenobu Yonemura

8. Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Yamanashi, Yamanashi 400-8510, Japan
Teruhiko Wakayama

79 翻訳機 :2018/10/10(水) 11:59:13
6.ゲノムリソース解析ユニット、理化学研究所発生生物学センター、神戸650-0047、日本
Mitsutaka Kadota &
Munazah Andrabi

7.電子顕微鏡検査室、理化学研究所発生生物学センター、神戸650-0047、日本
Shigenobu Yonemura

8.生命環境科学学部、山梨大学、山梨400-8510、日本
Teruhiko Wakayama

80 翻訳機 :2018/10/10(水) 12:00:29
(英文)
Contributions
H.O. and Y.S. wrote the manuscript. H.O., Y.S., M.K., M.A., N.T., S.Y. and T.W. performed experiments, and M.T. and Y.T. assisted with H.O.’s experiments. H.O., Y.S., H.N., C.A.V. and T.W. designed the project.

Competing financial interests
The authors declare no competing financial interests.

Corresponding authors
Correspondence to:
Haruko Obokata or
Teruhiko Wakayama or
Yoshiki Sasai

81 翻訳機 :2018/10/10(水) 12:01:10
貢献
H.O. 、Y.S. が原稿執筆し、 H.O.、Y.S.、M.K.、M.A.、N.T.、S.Y. 、T.W. が実験実施し、M.T. 、Y.T. がH.O.の実験補助し、 H.O.、Y.S.、H.N.、C.A.V. T.W. がプロジェクトを設計した。

利益相反
著者らは、利益相反の無いことを宣言する。

責任著者
下記へ連絡
Haruko Obokata or
Teruhiko Wakayama or
Yoshiki Sasai

82 司書 :2018/10/10(水) 12:01:51
(英文)
RNA-seq and ChIP-seq files have been submitted to the NCBI BioSample databases under accessions SAMN02393426, SAMN02393427, SAMN02393428, SAMN02393429, SAMN02393430, SAMN02393431, SAMN02393432, SAMN02393433, SAMN02393434 and SAMN02393435.

83 翻訳機 :2018/10/10(水) 12:02:21
RNA-seqおよびChIP-seqファイルは、SAMBI02393426、SAMN02393427、SAMN02393428、SAMN02393429、SAMN02393430、SAMN02393431、SAMN02393431、SAMN02393432、SAMN02393433、SAMN02393434およびSAMN02393435としてNCBI BioSampleデータベースに提出されている。

84 司書 :2018/10/10(水) 12:03:40
(英文)
Extended Data Figures

1. Extended Data Figure 1: Placental contribution of STAP cells. (295 KB)
a, Chimaeric mouse with STAP cells derived from CD45+ cells of B6GFP × 129/Sv mice (B6GFP, C57BL/6 line with cag-gfp transgene). Arrows indicate a placenta and a yolk sac. b, Cross-sections of yolk sac (top) and placenta (bottom). GFP-positive cells (arrows) were seen only in yolk sac and placenta of the STAP cell chimaera. Scale bars, 50 μm. c, Co-immunostaining showed that these GFP-positive cells (right) were found in the extra-embryonic endoderm-derived epithelial cells (pan-cytokeratin+ and overlying laminin+ basement membrane; left) of the yolk sac. Scale bar, 10 μm.

85 翻訳機 :2018/10/10(水) 12:04:46
拡張データ図

1.拡張データ図1:STAP細胞の胎盤寄与。 (295 KB)
a、B6GFP×129 / Svマウス(B6GFP、cag-gfp導入遺伝子を有するC57BL / 6系統)のCD45 陽性細胞に由来するSTAP細胞のキメラマウス。 矢印は、胎盤および卵黄嚢を示す。   b、卵黄嚢(上)および胎盤(下)の断面。 GFP陽性細胞(矢印)は、STAP細胞キメラの卵黄嚢および胎盤においてのみ見られた。 スケールバー、50μm。   c、共染色結果は、これらのGFP陽性細胞(右)が卵黄嚢の胚外内胚葉由来上皮細胞(汎サイトケラチン陽性かつ重層ラミニン陽性の基底膜;左側)に見出されたことを示した。 スケールバー、10μm。

86 司書 :2018/10/10(水) 12:06:34
(英文)
2. Extended Data Figure 2: Trophoblast differentiation potential of Fgf4-induced stem cells. (749 KB)
a, b, Immunostaining (cross-section) of placentae obtained in the blastocyst injection assay with GFP (constitutive)-labelled ES cells (upper) or Fgf4-induced stem cells (bottom). Brown shows pan-cytokeratin and red shows GFP (ES cell or Fgf4-induced stem cell contribution). Regions indicated in a are shown in b. Fgf4-induced stem cells contributed to all layers of placentae, whereas no contribution was observed with ES cells. a, Scale bars, 5 mm. b, Scale bars, 50 μm. c, Pluripotent marker expression of Fgf4-induced stem cells. Scale bars, 50 μm.
d, e, Effects of Fgf4 withdrawal from Fgf4-induced stem cell culture. Unlike trophoblast stem cells (d, left), which generated multi-nucleated large cells (arrow) in the absence of Fgf4, Fgf4-induced stem cells (d, right) simply stopped proliferation and gradually died on Fgf4 withdrawal. Scale bars, 50 μm. This finding suggests that placental differentiation of Fgf4-induced stem cells in vivo may involve more than just Fgf4 signal suppression. e, The number of 4N and 8N cells increased within 6 days of Fgf4 withdrawal in trophoblast stem cells but not in Fgf4-induced stem cells.

87 翻訳機 :2018/10/10(水) 12:07:40
2.拡張データ図2:Fgf4誘導幹細胞の栄養膜分化能。 (749 KB)
a,b,GFP(恒常性)標識ES細胞(上)またはFgf4誘導幹細胞(下)を用いた胚盤胞注入実験で得られた胎盤の免疫染色(断面)。 ブラウンは汎サイトケラチンを示し、赤はGFP(ES細胞またはFGF4誘導性幹細胞寄与)を示す。 aに示される領域は、bに示されている。 Fgf4誘導性幹細胞は胎盤のすべての層に寄与したが、ES細胞は寄与しなかった。 a、スケールバー、5mm。 b、スケールバー、50μm。    c,Fgf4誘導幹細胞の多能性マーカー発現。 スケールバー、50μm。
d,e,Fgf4誘導幹細胞培養からFgf4を除去した効果。 Fgf4の非存在下で大きな多能有核細胞(矢印)を形成する栄養膜幹細胞(d、左)とは異なり、Fgf4誘導性幹細胞(d、右)はFgf4を除去すると、単に増殖を停止し、徐々に死亡した。 スケールバー、50μm。 この知見は、インビボでのFgf4誘導幹細胞の胎盤分化は、単にFgf4シグナルの抑制以上のものを含む可能性があることを示唆している。    e、4Nおよび8N細胞の数は、栄養膜幹細胞においてFgf4の除去から6日間まで増加したが、Fgf4誘導性幹細胞では増加しなかった。

88 司書 :2018/10/10(水) 12:08:47
(英文)
3. Extended Data Figure 3: Transcriptome analyses of STAP cells shown by heat maps. (494 KB)
a, Heat maps of expression profiles of top-ranked up- and downregulated genes in STAP cells (Oct4-GFP+ clusters converted from CD45+ cells) compared to ES cells. Their respective expression levels in STAP stem cells, trophoblast stem cells and Fgf4-induced stem cells are shown. Absolute expression values are scaled by log2. The genes expressed differentially between ES cells and STAP cells tended to show more similar expression profiles to ES cells in STAP stem cells and Fgf4-induced stem cells than in trophoblast stem cells. Expression of some early endodermal lineage genes such as Gata4 and Sox17 was moderately elevated in STAP cells as compared to ES cells, whereas its biological significance remains elusive (these genes are shown to be strongly expressed in Oct4-GFP-dim cells1). b, Heat maps of expression profiles of top-ranked up- and downregulated genes in ES cells compared to CD45+ cells and their respective expression levels in STAP cells.
The genes expressed differentially between CD45+ and ES cells tended to show similar expression profiles in ES cells and STAP cells. c, Heat maps of expression profiles of representative genes implicated in haematopoietic lineage development in CD45+, ES and STAP cells. No strong correlation was seen between CD45+ cells and STAP cells in their expression profiles (a similar tendency of no correlation was seen for the data in b).

89 翻訳機 :2018/10/10(水) 12:09:37
拡張データ図3:ヒートマップ<翻訳機訳注:個々の値のデータ行列を色として表現した可視化グラフ>によって示されるSTAP細胞のトランスクリプトーム<翻訳機訳注:特定の状況下において細胞中に存在する全てのmRNA(ないしは一次転写産物、 transcripts)の総体を指す呼称>解析。 (494 KB)
a,ES細胞と比較した、STAP細胞(CD45陽性細胞から変換されたOct4-GFP陽性クラスター)における上位ランクのアップ或いはダウンレギュレート<翻訳機訳注:転写物の増減により製造蛋白質の量が増減する>された遺伝子の発現プロファイルのヒートマップ。 STAP幹細胞、栄養膜幹細胞およびFgf4誘導幹細胞のそれぞれの発現レベルが示されている。 発現の絶対値はlog2(翻訳機訳注:Excel関数用語で2を底とする対数の意、数学定義の常用対数、自然対数のLog2ではない。)でスケールされている(翻訳機訳注:横の色分けバー)。ES細胞とSTAP細胞との間の遺伝子発現の違いは、STAP幹細胞と栄養膜幹細胞よりも、STAP幹細胞とFgf4誘導幹細胞に、より類似した発現プロファイルを示す傾向があった。 Gata4およびSox17のようないくつかの初期内胚葉系遺伝子の発現は、ES細胞と比較してSTAP細胞では適度に上昇したが、その生物学的意義は依然として分かっていない(これらの遺伝子はOct4-GFP弱発現細胞で強く発現することが示されている)。    b,CD45 陽性細胞と比較した、ES細胞におけるトップランクのアップ或いはダウンレギュレートされた遺伝子の発現プロファイルのヒートマップおよびSTAP細胞のそれらに対応する発現レベル。
CD45 陽性細胞とES細胞との間の発現遺伝子の違いはSTAP細胞においても同様の傾向があった。    c,CD45陽性、ES細胞およびSTAP細胞における造血系統発生に関与する代表的遺伝子の発現プロファイルのヒートマップ。 CD45陽性細胞とSTAP細胞との間には、その発現プロファイルにおいて強い相関は見られなかった(bのデータについても同様の傾向は見られなかった)。

90 司書 :2018/10/10(水) 12:11:27
(英文)
4. Extended Data Figure 4: Transcriptome analyses for genes implicated in cell-cycle control and induced pluripotent stem-cell conversion. (452 KB)
a, Comparison of expression values of genes involved in cell-cycle control in ES and STAP cells; the G to M cell cycle phases (upper), the cell cycle checkpoint and cell cycle arrest (middle), and the cell cycle regulation (bottom) are shown. Expression level was measured by log2 of mean normalized counts. b, Heat map for upregulated genes in cells undergoing reprogramming by ‘Yamanaka factors’[14]. c, Heat maps for upregulated genes in pre-iPS cells[15] (top) and in partially reprogrammed cells by Yamanaka factors (bottom)[14]. Expression level was measured by log2 of mean normalized counts. Differentially expressed genes were identified by the DESeq package[21] and only genes with a false discovery rate of 1% were selected for comparison, unless mentioned otherwise.

91 翻訳機 :2018/10/10(水) 12:12:13
拡張データ図4:細胞周期制御および誘導された多能性幹細胞変換に関与する遺伝子のトランスクリプトーム解析。 (452 KB)
a,ES及びSTAP細胞における細胞周期制御に関与する遺伝子の発現値の比較; GからM細胞周期相(翻訳機訳注:細胞分裂のG0,G1,S,G2,Mの各段階)(上)、細胞周期チェックポイントおよび細胞周期停止段階(中)および細胞周期調節段階(下)が示されている。 発現レベルは平均正規化カウントのlog2によって測定されている。    b,「Yamanaka因子」[14]によって再プログラミングされている細胞におけるアップレギュレートされた遺伝子のヒートマップ。    c,pre-iPS細胞[15](上)およびYamanaka因子[14](下)による部分的に再プログラムされた細胞におけるアップレギュレートされた遺伝子のヒートマップ。 発現レベルは平均正規化カウントのlog2によって測定されている。。 示差的に発現された遺伝子は、DESeqパッケージ[21]によって同定され、他に言及されない限り、誤発見率1%の遺伝子のみが比較のために選択された。

92 司書 :2018/10/10(水) 12:13:38
(英文)
5. Extended Data Figure 5: Responses of Fgf4-induced stem cells to signal modifications. (333 KB)
a–f, JAK inhibitor treatment assay for Fgf4-induced stem cells. Fgf4-induced stem cells were cultured under feeder-free conditions and treated with 0.6 μM JAK inhibitor for 48 h. JAK inhibitor treatment assay eliminated ES cells (Oct4-GFP+) from the culture (a, b). The level of Oct4-GFP expression in Fgf4-induced stem cells, which was moderate, was maintained even after JAK inhibitor treatment (c, d; three independent experiments). Scale bar, 100 μm. e, f, For an additional control, Fgf4-induced stem cells were plated in trophoblast stem-cell medium containing Fgf4 together with Oct4-GFP ES cells that constitutively expressed BFP (the number of plated cells was one-tenth of that of plated Fgf4-induced stem cells). Whereas BFP-expressing colonies (ES-cell-derived) still expressed Oct4-GFP in trophoblast stem-cell culture medium after 2 days (e), no Oct4-GFP+ colonies from BFP-expressing ES cells were observed in the JAK-inhibitor-treated culture (f).
g, FACS analysis of integrin α7 expression in Fgf4-induced stem cells. Over 40% of Fgf4-induced stem cells strongly expressed both the pluripotency marker Oct4-GFP and the trophoblast marker integrin α7. The bottom panel shows an isotype control for integrin α7 antibody. In ES cells, integrin-α7-expressing cells were less than 0.1% (data not shown; three independent ES cell lines were examined).

93 翻訳機 :2018/10/10(水) 12:14:26
拡張データ図5:Fgf4誘導幹細胞のシグナル修飾に対する反応。 (333 KB)
a-f,Fgf4誘導幹細胞に関するJAK阻害剤処理実験。 Fgf4誘導幹細胞をフィーダー細胞無しで培養し、0.6μMのJAK阻害剤で48時間処理した。 JAK阻害剤処理実験は、ES細胞(Oct4-GFP 陽性)を培養物(a、b)から除去した。 Fgf4誘導幹細胞におけるOct4-GFP発現のレベルは、中等度ではあるが、JAK阻害剤処理後でも(c、d; 3回の独立した実験)維持された。 スケールバー、100μm。  e,f, 加えて別のコントロール実験として、Fgf4誘導性幹細胞を、Oct4-GFPとともにBFPを恒常的に発現する ES細胞(播種細胞数はFgf4誘導幹細胞数の数の1/10)と共にFgf4を含有する栄養膜幹細胞培地に播種した。      BFPを発現するコロニー(ES細胞由来)が2日後に栄養膜幹細胞培養培地中でOct4-GFPを依然として発現した(e)のに対して、BFP発現ES細胞由来のOct4-GFP 陽性コロニーはJAK阻害剤添加培地では観察されなかった(f)。
g,Fgf4誘導幹細胞のインテグリンα7発現のFACS解析。 Fgf4誘導幹細胞の40%以上が多能性マーカーであるOct4-GFPおよび栄養膜マーカーであるインテグリンα7の両方を強力に発現した。 下のパネルは、インテグリンα7抗体のアイソタイプコントロールを示す。 ES細胞では、インテグリンα7発現細胞は0.1%未満であった(データは示していない; 3つの独立したES細胞株を調べた)。

94 司書 :2018/10/10(水) 12:18:07
(英文)
6. Extended Data Figure 6: Characterization of ES-like cells converted from Fgf4-induced stem cells and comparison of STAP cells with early embryos. (316 KB)
a, Immunohistochemistry of ES-like cells for trophoblast and pluripotency markers. ES-like cells converted from Fgf4-induced stem cells no longer expressed the trophoblast marker (integrin alpha 7), but they did express the pluripotency markers (Oct4, Nanog and SSEA-1). Scale bar, 100 μm. b, Pluripotency of ES-like cells converted from Fgf4-induced stem cells as shown by teratoma formation. Those cells successfully formed teratomas containing tissues from all three germ layers: neuroepithelium (left, arrow indicates), muscle tissue (middle, arrow indicates) and bronchial-like epithelium (right). Scale bar, 100 μm. c, MEK inhibitor treatment assay for Oct4-gfp Fgf4-induced stem cells in trophoblast stem-cell medium containing Fgf4. No substantial formation of Oct4-GFP+ colonies was observed from dissociated Fgf4-induced stem cells in MEK-inhibitor-containing medium. Scale bar, 100 μm.
d, Cluster tree diagram from hierarchical clustering of global expression profiles. Red, AU P values. As this analysis included morula and blastocyst embryos from which only small amounts of RNA could be obtained, we used pre-amplification with the SMARTer Ultra Low RNA kit for Illumina Sequencing (Clontech Laboratories). e, f, Volcano plot of the expression profile of STAP cells compared to the morula (e) and blastocyst (f). Genes showing greater than 10-fold change and P value 1.0 × 10(to the power of−6 )are highlighted in red and are considered up- (or down-) regulated in the STAP cells.

95 翻訳機 :2018/10/10(水) 12:19:00
拡張データ図6:Fgf4誘導幹細胞から変換されたES様細胞の特徴付けおよびSTAP細胞と初期胚との比較。 (316 KB)
a,栄養膜マーカーおよび多能性マーカーに関するES様細胞の免疫組織化学。Fgf4誘導幹細胞から変換されたES様細胞は、栄養膜マーカー (integrin alpha 7)をもはや発現しなかったが、それらは多能性マーカー(Oct4、NanogおよびSSEA-1)を発現した。スケールバー、100μm。   b,テラトーマ形成によって示されたFgf4誘導幹細胞から変換されたES様細胞の多能性。これらの細胞は三胚葉すべてからの組織を含むテラトーマをきれいに形成した:神経上皮(左、矢印が示す)、筋肉組織(中、矢印が示す)および気管支様上皮(右)。 スケールバー、100μm。    c,Fgf4を含有する栄養膜幹細胞培地中のOct4-gfp陽性Fgf4誘導幹細胞に対するMEK阻害剤処理実験。 MEK阻害剤含有培地中の解離したFgf4誘導細胞から、Oct4-GFP陽性コロニーの実質的な形成は観察されなかった。 スケールバー、100μm。
d、グローバルな発現プロファイルの階層的クラスタリングによるクラスタツリー図。 赤、AU P値。 この分析には、少量のRNAしか得られない桑実胚および胚盤胞胚が含まれていたため、Illumina Sequencing(Clontech Laboratories)用のSMARTer Ultra Low RNAキットでプレ増幅を行った。    e,f,桑実胚(e)および胚盤胞(f)と比較したSTAP細胞の発現プロフィールの火山プロット。 10倍を超える変化およびP値1.0×10マイナス6乗を示す遺伝子は赤色で強調表示され、STAP細胞において上方(または下方)に調節されると考えられる。

96 サプリテーブルは省略 :2018/10/10(水) 12:19:59
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97 ふむ :2018/10/21(日) 07:48:46
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98 ふむ :2018/10/25(木) 06:31:22
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99 名無しさん :2018/12/06(木) 06:40:34
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100 名無しさん :2018/12/08(土) 07:17:45
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101 名無しさん :2018/12/19(水) 20:55:53
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102 名無しさん :2018/12/27(木) 05:28:44
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103 名無しさん :2019/01/07(月) 04:27:12
ふむ


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