STAP問題の全解に向けて、その19

145：参考：2018/02/26(月) 23:11:22: ＞私たちが知りたいのはまずこのGFPが何番染色体に入っているかを調べるのに、このCAG-GFPのプロモーター領域と構造遺伝子の前後とに合う相補的プライマー配列は若山さんが知ってたはずだということよね。

データベースに登録されているGFP遺伝子は、GFP遺伝子をはさむ部分に「特異的な塩基配列があることが分かっている」←キーポイント
それぞれのGFP遺伝子の特異的な塩基配列をNational Center for Biotechnology informationで調べてプライマーの設計をする。

例えば、pEGFP-N3遺伝子をインジェクトしたトランスジェニックマウス(プラスミドベクター)の場合、Mus musculus T-cell receptor 遺伝子に接してGFPを挿入されたその前後の配列はマウス第14染色体の中央部に挿入と分かっている。
Upper Primer 5’ CAAGGGCGAGGAGCTGTTCA 3’
Lower Primer 5’ TCGTCCATGCCGAGAGTGATC 3’

それぞれのプライマー20bp塩基配列のプライマー設計を民間にネット注文して送ってもらう(安価)。
サーマルサイクラーでPrimary PCRを行う。生成されたサンプルをDNA Auto Sequencerで解析しデータベースと照合して塩基配列の中にGFPが挿入されていることを確認する。

GFP遺伝子挿入部位の塩基配列決定（Genomic DNA Walking)
Template (Primary PCR 産物)+ Master Mix+ Upper Primer+ Lower Primer + D-waterでSecondary PCRをする。
方法:例えば、確認で得られたGFP挿入部位のプライマーは(pEGFP-N3遺伝子の場合)
5’ ACTATAGGGCACGCGTGGA 3’
5’ GCCATTTACCGTAAGTTATG 3’　
それぞれのプライマー設計をしてサーマルサイクラーでPCRにかける。
挿入部位の増幅された断片をDNA電気泳動にかけて得られたGFPバンドのゲルを切り出し融解、DNA精製してサンプルを取り出す。
塩基配列はDNA Auto Sequencer で調べる。その解析結果をNational Center for Biotechnology informationにアクセス。例えのプライマーの場合は、BLASTで検索してシーケンスの値とデータベースの値の一致率から何番染色体のどの位置に在るかが分かる。

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