遠藤論文、丹羽プロトコル - 1522974395

1：司書：2018/04/06(金) 09:26:35: 53：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/25(火) 07:04:08
『一塩基多型対立遺伝子頻度を用いたRNA-seqのための品質制御方法』

Takaho A. Endo*

Article first published online: 21 SEP 2014

ページ先頭
要約
導入
結果と検討
結論
実験経過
謝辞
照会
参考
69：司書：2018/04/06(金) 10:09:57: 151：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:42:27
＜要約＞
刺激惹起性多能性獲得（STAP）は最近2つの論文で報告された細胞の再プログラミング現象である (Obokata, Nature, 2014a,b)。この再プログラミングプロセスでは、強力な外部刺激に応じて、新生児の体細胞が、Oct3/4のような多能性関連遺伝子を発現し、体外体内および体内で、三胚葉すべての派生物に分化する能力を獲得した細胞に変換される。、STAP細胞と定義されたこれらの細胞は胚盤胞注入後にキメラ胎児に寄与することができる。それにとどまらず、胚盤胞注入試験において、注入されSTAP細胞はまた胎盤などの胚の外部組織においても見出される。
70：司書：2018/04/06(金) 10:10:29: 152：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:43:01
新生児の体細胞に由来するSTAP細胞はこのように多能性状態に完全に再プログラムされている。 STAP細胞の樹立のための条件下では、それらの増殖能力は、胚性幹細胞（ESCｓ）のものとは異なり、非常に制限されている。 STAP細胞はさらに二つのタイプ増殖性細胞株に変換することができる。STAP幹細胞およびFGF4誘発性幹細胞（FI幹細胞）である。ACTH含有培地の中で（手順参照）、STAP細胞から変換されたSTAP幹細胞は、胚の外部組織に貢献する能力を失う。FGF4含有培地中の中でSTAP細胞から生成されたFI幹細胞は、それらの胚への寄与は比較的低いが、胚盤胞注入検査で、胚および胚の外部系統の両方に貢献する能力を保持する。
71：司書：2018/04/06(金) 10:11:07: 153：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:43:36
外部刺激によって誘導されるSTAP現象は潜在的に哺乳動物細胞における多能性および分化に関する我々の理解に新たな光を投げかけるものである。この予期しない現象は例えば低pH溶液に過渡の曝すことによって新生児の造血細胞で惹起されうるものである。その見かけの単純さにかかわらず、この手順では細胞の取り扱いや培養条件のみならず、最初の細胞集団の選択にも特別な注意が必要である。細胞に最適レベルの亜致死刺激を与えることがSTAP細胞誘導の過程に不可欠である。我々の経験では、STAP変換はほとんどの細胞が低pH処理後一日生存し、その後初期細胞数の80％までが2から3日位で死亡するような培養条件で再現的に見られる。溶液のpHの調整だけが重要な要因ではなく、亜致死ストレスの遅発性も非常に重要である。
72：司書：2018/04/06(金) 10:11:42: 154：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:44:12
この生物学的状況はまた他の多くの要因によっても影響され得る。例えばストレスにさらす前後の体細胞の準備と取り扱いは、過剰な細胞死か、不十分な惹起性が引き起こされた場合に、細胞への追加ダメージがストレスレベルを変更することができるように、注意深く行なわれなければならない。STAP変換に使用される細胞のタイプも重要であり、他のソースからの細胞の使用（例えば、継代後の培養線維芽細胞の使用）もSTAP変換を達成するために障害をもたらし得る。適切な手順が正しい順序で行なわれている場合に我々はSTAP細胞の変換を再現的に観察している。
73：司書：2018/04/06(金) 10:12:18: 155：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:45:01
この技術の広範なテストと使用を容易にするために我々は今、ステップバイステップ手順の完全なプロトコル論文を準備中です。しかしながら、完全な原稿の作成、提出、公表にはかなりの時間がかかるので、我々は、このProtocol ExchangeでSTAP細胞の変換培養（および関連の実験）のための多くの技術的な秘訣を共有したいと思います。我々はこれらの技術的な秘訣が実験の詳細についてしばしば問われる多くの質問に答えることになることを願っています。
74：司書：2018/04/06(金) 10:12:53: 156：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:26:32
＜手順＞
***組織収集および低pH処理
1.　CD45陽性造血細胞を単離するために、1週齢のOct4-GFPマウス（特に指定のない限り）から脾臓が摘出され、ハサミによりミンチされ、そして機械的にパスツールピペットを用いて分離される。
[重要]
(i) 接着細胞は機械的または酵素的に（トリプシンまたはコラゲナーゼにより）単一細胞に解離されなければならない。図3ａ (Obokata et al. Nature, 2014a)で説明されている組織のうち、他の細胞が機械的に解離させられたのに対して、筋肉、脂肪組織および線維芽細胞は酵素的に解離させられている。
75：司書：2018/04/06(金) 10:13:38: 157：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:27:23
(ii)一次細胞が使用されるべきである。我々は新鮮なマウス胚線維芽細胞（MEF）なら可能であるが、体外で増殖されたMEFを再プログラムすることは困難であることをすでに知っている。
(iii) 報告されている実験のために、我々は、理化学研究所バイオリソースセンターによってGOF18-GFP株11トランスジェニックマウス(B6;B6D2-Tg(GOF18/EGFP)11/Rbrc)として維持されている、Oct-3/4-EGFPトランスジェニックマウス株を使っている(Ohbo et al, Dev Biol, 2003; Yoshimizu et al, Dev Growth Differ, 1999)。導入遺伝子のホモ接合体は、強化された信号を得るため、ライブイメージング用に使用されている。
(iv)1週間以上経過したマウス由来の細胞は現在のプロトコルの下では非常に貧弱な再プログラミング効率を示した。雄の動物からの細胞は雌からのものよりも高い効率を示している。
76：司書：2018/04/06(金) 10:14:10: 158：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:27:55
2.　解離脾臓細胞をPBS＜リン酸緩衝生理食塩水　Phosphate buffered saline＞で懸濁し、細胞濾過器（BD Biosciences社352340）で漉した。
3.　1000回転/分で５分間遠心分離した後、回収した細胞をDMEM培地＜ダルベッコ変法イーグル培地　Dulbecco's modified Eagle medium＞に再懸濁し、同じ体積のヒトリンパ球分離性溶液＜lympholyt＞（セダレーン社）を添加し、次いで20分間1000ｇで遠心分離した。
77：司書：2018/04/06(金) 10:14:43: 159：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:28:29
[重要]
（i）出発細胞の純度はSTAP変換を達成するために重要である。リンパ球にとって赤血球の混入が再プログラミング事象を阻害することがある。接着細胞を用いる場合には細胞外基質の存在が再プログラミングを妨害することがある。
（ii）代替手段として1.8 mlの水（シグマ社W3500）の中に細胞ペレットを懸濁することによって赤血球を除去してもよい。30秒後に、10倍濃度のPBS＜リン酸緩衝生理食塩水＞（ギブコ社70011-044）を0.2mlを、続いて１倍濃度のPBS（ギブコ社10010-023）3mlを加えて、細胞濾過器を通して細胞懸濁液を濾過する。
78：司書：2018/04/06(金) 10:15:16: 160：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:29:07
4.　リンパ球層を単離し、CD45抗体（Abcam社のab25603）で染色した。 CD45+細胞をFACSアリア（BD Biosciences社）によって選別した。
[重要]
（i）　FACSソーティングは細胞の純度を確保するための重要なステップであり得るが、細胞の生存率と初期化効率の両方に影響を与えうる。細胞出自の信頼性を減少させるかもしれないが、このステップをスキップすると初期化効率を高めることができる。
79：司書：2018/04/06(金) 10:15:48: 161：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:29:42
5.　細胞選別後、１００万個のCD45陽性細胞を37℃で25分間、低pH（塩酸によりpHを5.7に滴定）のHBSS＜ハンクス平衡塩溶液溶液＞500μlで処理し、次いで室温で1000rpmで5分間遠心分離した。
[重要]
（i）HBSSの緩衝作用が弱いため、溶液のキャリーオーバーがpHに影響する可能性がある。以下の方法に従ってpHを5.7に調整してください。まず、事前に4℃に冷却されたHBSS494μlに細胞ペレットを懸濁し、次に、5.7の最終pHに調整するために希釈塩酸（HBSS590μlに35％塩酸を10μl）を6μl追加する。パイロット実験で最終pHを確認し、加える塩酸の量を必要に応じて最適化してください。そうでなければ、事前に4℃に冷却されたHBSS-pH5.4に細胞ペレットを懸濁してください。
80：司書：2018/04/06(金) 10:16:19: 162：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:30:18
(ii)我々の使用したHBSSはCa2+/Mg2+ free（ギブコ社14170-112）である。
(iii)炭酸ガス培養器内でHBSSに懸濁した細胞を培養してください。
（iv）細胞生存率はこの行程における重要なパラメータである。図1dに示すように、最適な条件下で、大量の細胞死がプレーティング後2日目に観察される (Obokata et al. Nature, 2014a)。
(v)プレーティング後一日目で大量の細胞死があった場合は、低pHのHBSS溶液での培養期間を15分に短縮することによって改善することができる。
81：司書：2018/04/06(金) 10:17:08: 163：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:30:51
6.　上澄み（低pH溶液）を除去した後、沈殿細胞を再懸濁し、千U LIF（シグマ社）と2％のB27（インビトロジェン社）を入れたDMEM / F12培地の中の非接着性培養プレートに播種する（通常、１０万個細胞/ ml）。
[重要]
(i)非接着性培養プレートの使用が推奨される。なぜなら、細胞クラスターの形成は再プログラミングのための重要なステップであるが、接着性表面は、クラスタを形成するのに必要な細胞の移動を阻害しうるからである。
82：司書：2018/04/06(金) 10:17:43: 164：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:31:26
（ii）細胞密度は重要であり、それは細胞生存率に依存している。密度は培養表面1平方センチメートルあたり１０万から１００万個の細胞で維持されるべきである。
(iii)B27（インビトロジェン社17504-044）は商品バッチ間で違いのあることがある。 ES細胞のN2B27-2iLIF培養によって品質を確認してください。
7.　細胞のクラスター形成はOct3/4-GFP陽性細胞のパーセンテージに対してよりも、プレート移植されている細胞密度に対してより敏感であった。生存細胞数はドナーマウスの年齢に敏感であり、成長したマウス脾臓を用いた場合、上述した処理条件下で低かった。
83：司書：2018/04/06(金) 10:18:18: 165：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:31:58
[重要]
(i)ドナーマウスは1週齢もしくはもっと若くあるべきである。高齢の動物からの細胞を用いると再プログラミング効率は劇的に落ちる。
（ii）STAP細胞は複数の細胞のクラスタから誘導される。それらは単一種細胞ではない。
84：司書：2018/04/06(金) 10:20:20: 166：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:32:32
８.　2から7日目のにおけるのLIFの添加は、拡張データ図1ｆに示すように、7日目のOct3/4-GFP陽性STAP細胞クラスターを生成するために不可欠であった(Obokata et al. Nature, 2014a)。LIFの存在しない場合でも、Oct3/4-GFP陽性細胞（ほとんどが薄暗いシグナルを示したが）は培養2から5日の間に、低pH値で処理したCD45陽性細胞の中に一過的に現れたが、その後に姿を消した。LIF依存の次の段階に対してＬＩＦ非依存の初期段階のあることを示唆している。
85：司書：2018/04/06(金) 10:20:55: 167：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:33:02
[重要]
(i)再プログラミングの後期段階ではLIFは不可欠ですので、再プログラミング事象は遺伝的背景に依存しているのかも知れない。我々は主に129、C57BL6、またはそれらのF1株を使用したが、これらの遺伝的背景のすべてがLIFへの高い応答性に関連しているからである。
(ii) GFPシグナルは、同じレポーターを持っているES細胞のそれより弱いが、それは図1ｇに見られるように、STAP細胞の体積がES細胞よりも小さいためである(Obokata et al. Nature, 2014a)。
86：司書：2018/04/06(金) 10:21:34: 168：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:23:12
***STAP幹細胞変換培養
1. STAP幹細胞株を確立するために、 STAP細胞クラスターはMEFフィーダー細胞上のACTH含有培地に移される。（96ウェルプレートの1ウェルあたり１ダースまでの複数のクラスタ）
87：司書：2018/04/06(金) 10:22:08: 169：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:23:46
[重要]
(i)ACTH（1-24）は、アメリカンペプチド社および他の会社から入手可能である。我々は委託契約でクラボウによって合成されたACTHを使用していた。この培地の組成は、GMEM、15％ノックアウト血清代替TM（KSR、Invitrogen社）、1×非必須アミノ酸（NEAA）、1×ピルビン酸ナトリウム、10 -4 M2-メルカプトエタノール、1000U / mlのLIF、および10μM　ACTHである　(Ogawa et al, Genes Cells, 2004)。 STAP細胞のクラスターは図4a (Obokata et al. Nature, 2014a)にしめされた胚盤胞注入の場合のように単離され小片に切開され、ACTH培地中のマウス胚線維芽細胞フィーダー細胞上に播種された。
(ii)ACTH含有培地はステムミージャムアドレスのDSファーマバイオメディカル社（大阪、日本）から購入されている。
88：司書：2018/04/06(金) 10:22:46: 170：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:24:19
2.　培養の2から7日後に、細胞は従来のトリプシン法を使って第一段階に供され、懸濁した細胞を、20％FBS＜ウシ胎児血清　fetal bovine serum＞を含むES細胞維持培地に蒔種された。
[重要]
（i）ES細胞維持培地は KnockoutTM DMEM＜イーグル最小必須培地＞（Life Technologies社）、20％FBS、1×NEAA、1×グルタミン、1×ヌクレオシド、10 -4M　2-メルカプトエタノール及び1000 U/mlのLIFから構成されている。
（ii）のFBSロットは、マウスES細胞の培養に使用するための適合性が確認されるべきである。
89：司書：2018/04/06(金) 10:23:20: 171：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:24:52
（�睫）我々はCD45陽性造血細胞に由来するSTAP細胞から複数のSTAP幹細胞株を確立している。調べた8個のクローンのうちのいずれも再構成されたTCR対立遺伝子を含んでいなかった。このことはSTAP細胞が変換プロセスでSTAP幹細胞になるための、（もとの細胞の突然変異含む）陰性の細胞型依存バイアスの可能性を示唆している。これは現在のプロトコルにおいて、非新生細胞をもとの体細胞として使用したときに、STAP細胞の変換がそれほど効率的でなかったという事実に関係しているかも知れない。
90：司書：2018/04/06(金) 10:23:53: 172：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:25:27
3.　その後の継代はサブコンフルエント（シャーレ一杯になる前）に達するまでの二日置きに、1対10の分割比で行なった。我々はSTAP細胞クラスターからSTAP幹細胞を樹立するために、マウスの以下の3つの異なる遺伝的背景をテストし、再現性の確立を観察した。Oct4-GFP（29の29）を持つC57BL/6、Rosa26-GFP（2の2）をもつ129/ SV、および129/ CAG-GFP（16の12）をもつSV×C57BL/6。すべてのこれらの遺伝的背景を持つSTAP幹細胞はキメラ形成活性を示した。
91：司書：2018/04/06(金) 10:24:24: 173：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:25:59
***FI幹細胞変換培養
1. STAP細胞クラスターがFGF4を含む96ウェルプレート中のMEFフィーダー細胞上のＴＳ細胞＜栄養芽層幹細胞＞培地 (Tanaka et al, Science, 1998)に移される (Obokata, Nature, 2014b)。
[重要]
（i）TS培地は20％のFBS＜ウシ胎児血清＞を含むRPMI1640＜ロズウェルパーク記念研究所培地　Roswell Park Memorial Institute medium＞、1mMのピルビン酸ナトリウム、100μMの2-メルカプトエタノール、2mMのL-グルタミン、組換えFGF4の25 ng / ml及びヘパリンの1μg/mlで構成されている。
(ii)FBSのロットの違いは培養細胞の挙動に重大な差異をもたらしうる。
92：司書：2018/04/06(金) 10:24:56: 174：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:26:38
2.　ほとんどの場合（40から50回の実験）、コロニーは96ウェルプレートのウェルの10から50％までに成長した。少数の例（50のうちの１０回の実験）では、全くコロニー増殖が観察されずに、かつ/または、わずかの線維芽細胞様細胞が出現した。
重要
(i)増殖コロニー内の細胞はまた線維芽細胞のように現れるが、徐々に形態を変更して上皮細胞に似てくる。
93：司書：2018/04/06(金) 10:26:01: 175：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:27:14
3.　細胞を従来のトリプシン法を用いて7-10日間の最初の継代に供した。それらがサブコンフルエントに達する前に３日おきに４対１の分割比でその後の継代を行った。
[重要]
(i) 細胞は完全に解離されてはいけない。胚由来のトロホブラスト幹細胞の場合に見られるように、部分的な解離が生存能力および自己再生を維持するのに最適である。
94：司書：2018/04/06(金) 10:26:36: 176：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:27:47
＜参照＞
Obokata, H. et al.Obokata.　『体細胞の多能性への刺激惹起性運命変換』Nature, 505, 641-647 (2014a)
Obokata, H. et al.　『取得多能性を持つ再プログラム細胞における双方向への発生能力』 676–680 (2014b)
Ohbo, K. et al.　『マウスの小さな星の中に満たされた思春期前の精子形成における幹細胞の同定と特徴づけ』　Dev. Biol. 258, 209–225 (2003)
95：司書：2018/04/06(金) 10:27:10: 177：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:28:21
Yoshimizu, T. et al.　『マウスのOct4/緑色蛍光タンパク質（GFP）導入遺伝子の生殖細胞特異的発現』　Dev. Growth. Differ. 6, 675-684 (1999)
Ogawa, K., Matsui, H., Ohtsuka, S. & Niwa, H.　『マウスES細胞のクローン増殖を調節するための新しいメカニズム』　Genes Cells 9, 471–477 (2004)
Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. & Rossant, J.　『FGF4＜線維芽細胞増殖因子＞によるＴＳ細胞増殖の推進』　Science 282, 2072–2075 (1998)
96：司書：2018/04/06(金) 10:27:41: 178：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:28:55
＜関連著作物＞
このプロトコルは下記論文に関連している。
『体細胞の多能性への刺激惹起性運命変換』
Haruko Obokata, Teruhiko Wakayama, Yoshiki Sasai, Koji Kojima, Martin P. Vacanti, Hitoshi Niwa, Masayuki Yamato, and Charles A. Vacanti
Journal title
Nature
Vol.
505
Issue
-7485
Pages
641 - 647
Publication date
29/01/2014
DOI:
doi:10.1038/nature12969
97：司書：2018/04/06(金) 10:28:14: 179：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:29:33
『取得多能性を持つ再プログラム細胞における双方向への発生能力』
Haruko Obokata, Yoshiki Sasai, Hitoshi Niwa, Mitsutaka Kadota, Munazah Andrabi, Nozomu Takata, Mikiko Tokoro, Yukari Terashita, Shigenobu Yonemura, Charles A. Vacanti, and Teruhiko Wakayama
Journal title
Nature
Vol.
506
Issue
-7484
Pages
677 - 680
Publication date
29/01/2015
DOI:
doi:10.1038/nature12970
98：司書：2018/04/06(金) 10:36:49: 180：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:30:06
＜著者紹介＞
［所属］
1.細胞リプログラミング研究室、理研CDB
小保方晴子
2.器官発生・神経発生研究室、理研CDB
笹井芳樹
多能性幹細胞解明研究室、理研CDB
丹羽仁
［金銭的利益相反］
著者等は金銭的利益相反のないことを宣誓します。
［責任著者］
連絡はこちらへ
丹羽仁史（アドレス）
99：司書：2018/04/06(金) 10:37:24: 181：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:30:39
以上
100：ふむ：2018/04/06(金) 10:38:10: 😭　😃　😵　😒　😣　😝　😔　😳　😡　😱　🐝　🌅　👰　🙅　🙍
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101：鉄：2018/04/06(金) 10:39:33: イェイ。
102：鉄：2018/04/08(日) 08:36:32: イェイ。
103：鉄：2018/04/09(月) 12:53:00: イェイ。
104：鉄：2018/04/12(木) 13:35:24: イェイ
105：鉄：2018/04/13(金) 21:54:13: イェイ
106：鉄：2018/04/18(水) 20:03:30: イェイ。
107：鉄：2018/04/19(木) 03:51:17: イェイ。
108：鉄：2018/04/19(木) 03:53:47: イェイ。
109：鉄：2018/04/20(金) 07:19:34: イェイ。
110：鉄：2018/04/22(日) 06:53:11: イェイ。
111：鉄：2018/04/23(月) 06:00:20: イェイ。
112：鉄：2018/04/24(火) 06:24:58: イェイ。
113：鉄：2018/04/25(水) 03:11:04: イェイ。
114：鉄：2018/05/04(金) 05:37:12: イェイ。
115：鉄：2018/05/04(金) 18:01:30: イェイ。
116：鉄：2018/05/05(土) 04:32:32: イェイ。
117：鉄：2018/05/05(土) 11:49:44: イェイ。
118：自死の自由を！安楽死施設をつくりましょう！：2020/02/25(火) 22:27:20: 自死の自由を！

安楽死施設をつくりましょう！