STAP問題の全解に向けて - 1492994857

1：名無しさん：2017/04/24(月) 09:47:37: ここは広くていいぞ。
860：閲覧者：2017/05/16(火) 17:28:42: 集合キメラの作り方だけど、４N胚を３個というのが特許発見で、これで達成率が１割から２割にまで
上がると主張しているわけだね。
861：小野小町：2017/05/16(火) 17:29:31: 【００１４】
本明細書で用いられる「ＥＳ細胞」は、胚盤胞期の受精卵の内部細胞魂（ＩＣＭ）に由来する、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞を意味する。これまで、ホストとして４倍体胚を用いる効率的なＥＳ動物の作成においては、樹立されたＦ１由来のＥＳ細胞が使用されている（非特許文献４）。しかし、本発明では、ＥＳ細胞はあらゆる種類のものであってよく、当業者間で一般的に用いられるものを適用することができる。例えば、Ｅ１４、Ｒ１またＡＢ－１などの１２９系統に由来する細胞株、あるいはＴＴ２などの市販されている細胞株を含むが、これだけに限らない。また、本発明で用いるＥＳ細胞は、近交系または交雑系に由来する上記のごとき一般的なＥＳ細胞株であってよく、好ましくは近交系に由来するものである。本明細書で用いられる「近交系」とは、２０世代またはそれ以上にわたり兄妹交配が行われてきた系統のことをいう。また、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１、ＢＤｍｔ２またはＤＦＣ３Ｈのごとき核移植胚由来のＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）を本発明の方法に用いることができる。これらのｎｔＥＳ細胞は発明者らの研究室にて樹立された。ここで、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１はＧＦＰを発現する１２９Ｂ６Ｆ１系統のセルトリ細胞であり、ＢＤｍｔ２はＢＤＦ１系統の繊維芽細胞を用いた核移植胚由来のｎｔＥＳ細胞であり、ならびにＤＦＣ３ＨはＣ３Ｈの脳細胞から樹立した近交系に由来するｎｔＥＳ細胞である。
862：閲覧者：2017/05/16(火) 17:34:49: <１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１はＧＦＰを発現する１２９Ｂ６Ｆ１系統のセルトリ細胞>とあるのは
精巣の細胞なんでアクロシンGFPなんだね。太田さんの論文何だから無論岡部マウスだよね。
863：小野小町：2017/05/16(火) 17:36:02: 【００１５】
さらに、本発明に用いられうるＥＳ細胞は、ＥＳ細胞に類似した性質（本発明でドナーのＥＳ細胞として用いることができる性質）を有する細胞であってもよく、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などを含むが、それだけに限らない。
864：閲覧者：2017/05/16(火) 17:43:06: ２００８年から２００９年にかけての特許申請だよね。
IPSは２００６年の成功で２０１２年のノーベル賞受賞だね。
無論小保方STAPでもいいわけだよな。
もっともこれはできなかったと見てるが。出来ていたと言う人たちは
論文通りではないがこれも考えるのかな。
865：小野小町：2017/05/16(火) 17:44:50: 【００１６】
また、本発明に用いられるＥＳ細胞において、特定の遺伝子が導入されているか、または特定の遺伝子がノックアウトされていてもよい。
【００１７】
ＥＳ細胞を適当な条件で培養してから、４倍体胚に移入することができる。ＥＳ細胞の培養は、当該技術分野において一般的な方法を用いて行われてよい。例えば、基本培地として、KNOCKOUT（登録商標）DMEM（Invitrogen, CA, USA）を用いてよい。また、添加物として２０％胎児ウシ血清（Sigma-Aldrich, MO, USA）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）（１０００ユニット／ｍｌ，Invitrogen）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（invitrogen）、１％Ｌ－グルタミン（Specialty Media, NJ, USA）、１％非必須アミノ酸（Specialty Media）、１％ヌクレオシド（Specialty Media）、または１％ β－メルカプトエタノール（Specialty Media）を添加して培養したものであってよい。
【００１８】
また、本発明では、ＥＳ細胞の培養は、ゼラチンでコートしたディッシュ（フィーダー細胞非存在）上で行われてもよい。
【００１９】
本発明では、４倍体胚に移入されるＥＳ細胞の数は、１個以上であってよい。また、４倍体胚に移入されるＥＳ細胞の数は、好ましくは８～１５個である。移入されるＥＳ細胞は細胞塊として移入されてよい。本発明における移入は、例えば、ＥＳ細胞を４倍体胚に接触させる、あるいは注入することによって行ってもよい。これらの操作は、顕微鏡またはマイクロマニピュレータを使って行われるのが一般的である。
866：閲覧者：2017/05/16(火) 17:47:52: 0019の<あるいは注入することによって行ってもよい。>というのはインジェクションで
３個の４倍体胚を使うというのとちょっと違ってないかな。どうせ説明してくれる専門家もいないんだろうけどね。
ど素人の悲しさだね。
867：小野小町：2017/05/16(火) 17:49:25: 【００２０】
本明細書で用いられる「キメラ胚」は、由来の異なる２個以上の胚由来の細胞の結合により得られた胚を意味する。本発明に用いられうるキメラ胚は、好ましくは３個または４個の４倍体胚にＥＳ細胞を移入して培養した胚である。キメラ胚の培養は、例えば、ＣＺＢ培地にて約２４時間行われてよい。これらの条件は当業者が適宜定めうる。
868：閲覧者：2017/05/16(火) 17:50:58: 好ましくないのがインジェクションということなのかな。特許独特の定義なのかな。
869：小野小町：2017/05/16(火) 17:51:34: 【００２１】
次に、３個または４個の４倍体胚にＥＳ細胞を移入し、適当な条件で培養することにより得られたキメラ胚を偽妊娠非ヒト動物に移植して、子供を産ませ、ＥＳ動物を得る。キメラ胚を、偽妊娠非ヒト動物の卵管内または子宮内に移植してもよい。偽妊娠非ヒト動物は、ＥＳ細胞が由来する動物と同種の動物であればよく、系統が異なっていてもまたは同一であってもよい。例えば、偽妊娠非ヒト動物は、偽妊娠２．５日目のＩＣＲマウスであってもよいが、これだけに限定しない。本発明で用いられるキメラ胚の移植は、当業者間で一般的に用いられる方法によって行われうる。次いで、当業者間で一般的な方法に従って仮親（キメラ胚を移植された偽妊娠非ヒト動物）を飼育し、出産させてＥＳ動物を得ることができる。
870：閲覧者：2017/05/16(火) 17:53:37: ここは誰でも分かるよ。
871：小野小町：2017/05/16(火) 17:54:21: 【００２２】
前記のごとく、３個または４個、とりわけ３個の４倍体胚をホストとしてＥＳ動物を作成すると、従来の方法と比較して作成効率を高めることができる。また、この本発明の方法では、あらゆるＥＳ細胞が使用でき、例えば近交系由来のＥＳ細胞でも使用可能という利点を有する。さらに本発明の方法により得られたＥＳ動物は、奇形頻度が従来のＥＳマウスと同程度であり、十分に実用に供することができる。
872：閲覧者：2017/05/16(火) 17:55:05: なるほど、そうですか、と。
873：小野小町：2017/05/16(火) 17:55:50: 【００２３】
次に、下記の実施例に用いた主な材料および方法を示すが、本発明を限定するものではない。
【００２４】
使用したマウスおよびＥＳ細胞
ＢＤＦ１およびＩＣＲマウスはＳＬＣ（浜松、日本）から購入し使用した。ＩＣＲバックグラウンドのＧＦＰトランスジェニックマウスはｐＣＡＧ－ＥＧＦＰをベクターとして以前発明者らの研究室で樹立したものを使用した。使用したＥＳ細胞は４種類で、一般的なＥＳ細胞としてＥ１４（Hooper M, Hardy K, Handyside A et al. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature 1987;326:292-295）、核移植胚由来のＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）として、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１、ＢＤｍｔ２およびＤＦＣ３Ｈを使用した。Ｅ１４は、１９８５年にＭａｒｔｉｎＨｏｏｐｅｒ博士（Edinburgh, Scotland）らにより樹立され、ＰｅｔｅｒＭｏｍｂａｅｒｔｓ博士（Rockefeller University）が培養・保存していたものを分与して頂いた。１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１は、ＧＦＰを発現する１２９Ｂ６Ｆ１系統のセルトリ細胞、ＢＤｍｔ２はＢＤＦ１系統の繊維芽細胞を用いた核移植胚由来のｎｔＥＳ細胞で、以前発明者らの研究室で樹立されたものを使用した。また近交系由来のｎｔＥＳ細胞として、Ｃ３Ｈの脳細胞から樹立したｎｔＥＳ細胞（ＤＦＣ３Ｈ）を１０株ランダムにＥＳマウスの作成に使用した。
【００２５】
ＥＳ細胞の培養条件
ＥＳ細胞の培養は一般的な条件に従って行った。基本培地としてKNOCKOUT（登録商標）DMEM（Invitrogen, CA, USA）を用い、下記の添加物を加えたものを培養液として使用した：２０％胎児ウシ血清（Sigma-Aldrich,MO,USA）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）（１０００ユニット／ｍｌ，Invitrogen）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（invitrogen）、１％Ｌ－グルタミン（Specialty Media, NJ, USA）、１％非必須アミノ酸（Specialty Media）、１％ヌクレオシド（Specialty Media）、１％ β－メルカプトエタノール（Specialty Media）。ＥＳ細胞はゼラチンコートを施したディッシュ上においてフィーダー細胞非存在下で培養した。
874：閲覧者：2017/05/16(火) 18:00:46: 動物実験申請書にあるマウス購入業者の黒塗りの下にはＳＬＣ（浜松、日本）も
ありそうだね。ここに裏金蓄積があつたりして。E14なんてESも保存しているのね。
譲ってもらったんだから今でも大事に保管してるでしょうね。太田ESだって保管して
いるはずなんだけどね。
875：一言居士：2017/05/16(火) 18:01:49: 野依さんも痛い腹はあったんでしょうねえ。
876：小野小町：2017/05/16(火) 18:03:44: ま、ま、そこは別問題として。

【００２６】
４倍体胚の作成とＥＳマウスの作成
本実験で使用した４倍体胚は２種類の胚から作成した。１つはＢＤＦ１の精子と卵子を顕微授精（ＩＶＦ）させた胚（ＢＤＦ２）であり、もう１つはＩＣＲＧＦＰ雄とＩＣＲ雌を交配させた胚を使用した。後者の胚（ＩＣＲＧＦＰ）ではＧＦＰを発現するため、４倍体胚に由来する細胞の存在を緑色蛍光により確認できる。ＩＶＦは一般的に用いられている方法を用いて行った。具体的には、ＢＤＦ１マウスの精巣上体尾部から精子を回収し、ＴＹＨ培地（Toyoda Y, Yokoyama M, Hoshi T. Studies on fertilization of mouse eggs in vitro: I. In vitro fertilization of eggs by fresh epididymal sperm. Jpn J Anim Reprod 1971;16:147151）にて培養した。卵子は過排卵処理を施した雌ＢＤＦ１から採取し、ＴＹＨ培地を用いて培養した。ここに精子を１ｘ１０５細胞／ｍｌになるように添加することによりＩＶＦを行った。ＩＶＦ後、授精した胚を回収し、２細胞期胚を得るため、ＣＺＢ培地（Chatot CL, Ziomek CA, Bavister BD et al. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 1989;86:679-688）において２４時間培養した。一方、ＩＣＲＧＦＰ胚を得るためには、過排卵処理を施したメスＩＣＲと、オスＩＣＲＧＦＰマウスを一晩交配させた。翌朝、交配を確認し、その２４時間後に卵管を採取し、２細胞期の胚を回収した。ＢＤＦ２およびＩＣＲＧＦＰの２細胞期の胚を、電気融合装置（Model LF101、ネッパジーン（株）、千葉）を用いて電気融合させ、４倍体胚を作成した。電気融合に成功した胚を選別し、ＣＺＢ培地にて一晩培養した。
877：閲覧者：2017/05/16(火) 18:06:45: 小保方さんが理研に来る前にこのラボではこんなことをしてたんだねエ。
小保方さんがきてからも彼が顕微授精してたのを見たんだね。嘘でなければ。
878：一言居士：2017/05/16(火) 18:10:16: 見てもないことを空想で書くって、まずそれを思いつくことが大変だろうね。
もっともこんなふうな論文を読んでいれば創作は可能かも知れないが。
879：小野小町：2017/05/16(火) 18:15:13: 【００２７】
２～４細胞期に発生した４倍体胚を選別し、アシッドタイロード溶液を用いて透明帯を除去した。次いで、プラスチックディッシュ上に作成した小さな窪みに、１個（１ｘ）から３個（３ｘ）の４倍体胚を入れた。さらにその上から８～１５個のＥＳ細胞の細胞塊を入れることにより、ＥＳ細胞と４倍体胚のキメラ胚を作成した。ＣＺＢ培地にて２４時間培養後、得られたキメラ胚を偽妊娠マウス（偽妊娠２．５日目）の子宮内に戻した。これらのマウスを妊娠１８日目で帝王切開し、産仔の有無を解析した。
880：閲覧者：2017/05/16(火) 18:16:15: 集合キメラができました、と。
881：小野小町：2017/05/16(火) 18:16:59: 【００２８】
胚盤胞期胚の細胞数の解析
胚盤胞期の細胞数を数えるため、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色およびＣｄｘ２の免疫染色を行った。ＰＩでは全ての細胞が染まるため、全細胞数の指標として使用し、抗Ｃｄｘ２抗体では栄養外胚葉（ＴＥ）細胞のみが染まるため、ＴＥ細胞の細胞数の指標として使用した。細胞内部魂（ＩＣＭ）の細胞数を、全細胞数（ＰＩ陽性細胞）からＴＥ細胞数（Ｃｄｘ２陽性細胞）を差し引いた細胞数として計算した。具体的には、１ｘから３ｘの４倍体胚を胚盤胞期まで発生させ、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し（室温で４５分間）、ＰＢＳで３回洗浄後、抗Ｃｄｘ２抗体（１：２００； BioGenex, CA, USA）を室温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、２次抗体（goat anti-mouse IgG conjugated with Alexa Fluor 488; Molecular Probes, Eugene, OR, USA）と室温で３０分間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、１μｇ／ｍｌのＰＩ溶液に移し、共焦点顕微鏡を用いてそれぞれの胚盤胞期胚を撮影した。細胞数のカウントには、焦点写真をMetaMorph software（Universal Imaging Co., Downingtown, PA, USA）を用いて立体構築し、ＰＩ陽性細胞数およびＴＥ陽性細胞数をカウントした。この解析には、正常胚（１ｘ２ｎ）および１ｘないし３ｘの４倍体胚に由来する胚盤胞期の胚をそれぞれ１０個ずつ使用してカウントした。
882：閲覧者：2017/05/16(火) 18:20:19: 細胞数のカウントしたことが無いなんて言ってた人居なかったかな。それに染色も
小保方さんに任せなくても自分たちでできるんだし、パラフィンブロックも作れるのね。
ははは、博士さん達なんだから当たり前だよね。当たり前でないのはやったことないなんて
言ってることのほうだよねえ。
883：一言居士：2017/05/16(火) 18:21:47: はっはっは。白々しいにもほどがある。
884：小野小町：2017/05/16(火) 18:23:46: 【００２９】
新生仔ＥＳマウスの解析
ＥＳマウスを妊娠１８日目で帝王切開し、体重、胎盤重量の測定、および奇形（腹部ヘルニア、開眼、巨大産仔）の有無を観察した。また、ホストとしてＩＣＲＧＦＰの４倍体胚を用いた実験では、ＥＳマウスにおいて４倍体胚由来の細胞の有無を調べるため、ＥＳマウスの肝臓および脳組織を用いてフローサイトメトリーを行った。具体的には、新生仔ＥＳマウスから肝臓および脳を摘出し、ハサミで細切後、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液で培養した（３７℃で１５分間）。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを等量添加後、遠心分離し（３００ｇで７分間）、上清を捨てた後、ＰＢＳで同様に２回洗浄した。細胞を１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭに懸濁し、フローサイトメトリーに使用した。フローサイトメトリーにはＦＡＣＳａｒｉａ（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）を用い、それぞれの組織における主要細胞群を側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）を指標として同定した。主要細胞群中のＧＦＰ陽性細胞数を測定することにより、４倍体胚由来の細胞を同定した。
885：閲覧者：2017/05/16(火) 18:47:54: これは基本的には太田さんの実験なんだけど若山さんがボスだからね。若山さんが
フローサイトメトリーのやり方を知らないと言うことは考えられない。しかし、
手記には小保方さんが若山さんにセルソーターの機械の使い方を教えてあげたというくだりがあるね。
若山さん小保方さんの程度を試していないかな。
886：一言居士：2017/05/16(火) 18:48:59: 95Pだね。あの下りは細胞の作り方を盗もうとしているとも見えるところだな。
887：小野小町：2017/05/16(火) 18:50:10: 【００３０】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例】
【００３１】
Ａ．倍化ＥＳマウスの出産率の比較
本実験の目的は、複数の４倍体胚を用いることによりＥＳマウスの作成効率の向上を図ることである。そのためにまず、正常胚を用いて、倍化胚（３ｘおよび５ｘ）を作成し、その発生能を解析した。その結果、３ｘ正常胚では正常な範囲内で産仔を得ることに成功したが（５０％；８／１６）、５ｘ正常胚からは産仔を得るにいたらなかった（０％；０／８）。以上の結果から、過剰な胚の数は発生能を障害することが示唆された。この結果を元に本実験では１ｘから３ｘの４倍体胚とＥＳ細胞のキメラ胚を作成し、ＥＳマウスの出産率を比較検討した。
888：閲覧者：2017/05/16(火) 18:51:07: なるほど。
889：閲覧者：2017/05/16(火) 18:51:43: 【００３２】
Ｂ．倍化４倍体胚の細胞数の解析
ＥＳマウスの作成の前に、まず、倍化した４倍体胚の細胞数が実際に増加しているのかを検討した。授精後９６時間の１ｘから３ｘの４倍体胚をそれぞれ１０個ずつＰＩとＣｄｘ２の２重染色を行った。以前の報告（Koizumi N, Fukuta K. Preimplantation development of tetraploid mouse embryo produced by cytochalasin B. Exp Anim. 1995;44(2):105-109）と一致して、１ｘ４倍体胚では正常胚（１ｘ２ｎ）と比較して総細胞数の減少が認められた（表１および図１Ａ－Ａ”、Ｄ－Ｄ”）。一方で、２ｘ４倍体胚および３ｘ４倍体胚では、総細胞数の増加が確認された（表１および図１Ｂ－Ｂ”、Ｃ－Ｃ”）。これらの２ｘ４倍体胚および３ｘ４倍体胚では、ＴＥ細胞数およびＩＣＭ細胞数もそれぞれ増加していることが示された（表１）。また、３ｘ４倍体胚を抗Ｏｃｔ３／４抗体で免疫染色したところ、正常にＩＣＭ細胞が染色された（図１Ｅ－Ｅ”）。以上の結果から、胚盤胞期の倍化４倍体胚では、予想通り細胞数が増加しており（表１）、ＩＣＭなどへの分化も正常に行われることが証明された（図１Ｅ－Ｅ”）。
（表１．倍化４倍体胚の細胞数の解析）
【表１】
890：小野小町：2017/05/16(火) 18:54:54: あら自分で貼り付けたの?
【００３３】
Ｃ．倍化４倍体胚を用いたＥＳマウスの作成効率の検討
先の実験で倍化４倍体胚の細胞数の増加が確認されたので、次にＥＳマウスの作成効率の検討を行った。使用したＥＳ細胞は、一般的なＥＳ細胞株であるＥ１４、ｎｔＥＳ細胞として１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１（ＧＦＰ陽性）およびＢＤｍｔ２、ならびに近交系由来のＥＳ細胞株としてＤＦＣ３Ｈ（合計１０株をランダムに使用）を用いた。図２に示したように、ＧＦＰを発現する１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１を用いてキメラ胚を作成したところ、３ｘ４倍体胚にＥＳ細胞が正常に取り込まれることが示された（図２Ｄ－Ｆ）。
【００３４】
次に、各ＥＳ細胞と１ｘないし３ｘの４倍体胚とのキメラ胚を作成し、胚移植後の発生能の検討を行った。１ｘおよび２ｘ４倍体胚をホスト胚として用いた場合では、３系統のＥＳ細胞（Ｅ１４、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１およびＢＤｍｔ２）は、ＥＳマウスの作成効率が約１－３％と非常に低頻度であった（表２）。一方、３ｘ４倍体胚を用いた場合では、その作成効率が約２．５－８．５倍に向上した（８．６％：表２）。また、従来作成が困難と考えられていた近交系由来のＥＳマウスでも、３ｘ４倍体胚を用いることにより約７％の成功率で作成可能であることが示された（表２）。
【００３５】
以上の結果から、２ｘ４倍体胚では正常胚と同程度の細胞数を有するが（表１）、ＥＳマウスの作成効率は、３ｘ４倍体胚を使用したものが最も効率がよく（表２）、従来法の１ｘもしくは２ｘ４倍体胚では不十分であることが示された。
（表２．倍化４倍体胚を用いたＥＳマウスの作成効率の検討）
【表２】
891：閲覧者：2017/05/16(火) 18:55:50: なるほど。
892：小野小町：2017/05/16(火) 18:56:55: *:E14;一般的に用いられているES細胞。129B6F1G1およびBDmt2;ntES細胞。DFC3H;近交系由来ntES細胞。
【００３６】
Ｄ．倍化４倍体胚より作成された新生仔ＥＳマウスの解析
ＥＳマウスは奇形仔の頻度が高いことが知られているので、次に３ｘ４倍体胚より作成されたＥＳマウスの表現型を観察した。３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスは、体重・胎盤重量とも１ｘまたは２ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスと同程度であった（表３）。また開眼・腹部ヘルニア・巨大産仔の出現率なども差は認められなかった（表３）。以上の結果から、３ｘ４倍体胚を用いた場合であってもＥＳマウスの奇形頻度は、少なくとも従来のＥＳマウスと同程度であることが示された。
893：閲覧者：2017/05/16(火) 18:58:58: 奇形が多いんだね。でも今までとたいして変わらない頻度なんだから達成率の高さが自慢だと。
894：小野小町：2017/05/16(火) 19:00:03: 【００３７】
ＥＳマウスの最大の特徴は、体を構成しているほぼ全ての細胞がＥＳ細胞由来であるという点である。表１に示したように、３ｘ４倍体胚では、総細胞数のみならず、体を構成しうるＩＣＭ細胞も増加している。最後に、３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスが実際にＥＳ細胞由来の細胞で構成されているかを検討した。
【００３８】
ホストである４倍体胚由来の細胞とＥＳ細胞を区別するため、ＥＳ細胞にはＥ１４、ホストにはＩＣＲＧＦＰ由来の４倍体胚を使用した。このことにより、４倍体胚由来の細胞がＧＦＰを発現するため、ＥＳマウスにて４倍体由来の細胞を容易に確認することが可能となる。この方法を用いて、３ｘ４倍体胚から合計１５匹のＥＳマウスを作成し、蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。図３に示すように、得られた１５匹すべてにおいて、胎盤でＧＦＰが発現し、産仔では発現していなかった（図３Ａ－Ｃ）。これらの結果から、３ｘ４倍体胚を使用してもＥＳマウスに４倍体胚由来の細胞が大きく混入する可能性は低いと考えられる。次に、より詳細な解析を行うため、フローサイトメトリーによるＧＦＰ細胞の検出を行った。１ｘおよび３ｘ４倍体胚より作成したＥＳマウスをそれぞれ２匹ずつ使用し、脳および肝臓におけるＧＦＰ陽性細胞を検出した。解析の結果、１ｘおよび３ｘ４
【００３９】
倍体胚由来のＥＳマウスとも、４倍体胚由来のＧＦＰ細胞の混入率は１％未満であった。
以上の結果から、３ｘ４倍体胚を用いたＥＳマウスは、従来法に由来するＥＳマウスと同様に、ほぼ全ての構成細胞がＥＳ細胞由来であることが証明された。
（表３、ＥＳマウスの表現型の解析）
【表３】

a平均±SD(g)。
bOE:開眼、AH:腹部ヘルニア、LO:巨大産仔、OELO:開眼および巨大産仔を併発した仔、OEAH:開眼および腹部ヘルニアを併発した仔。
895：閲覧者：2017/05/16(火) 19:01:52: えっ、４倍体でも１%未満とは言えリシピエント胚の混入があるんだ?
896：一言居士：2017/05/16(火) 19:05:21: クローンか４倍体キメラかの区別はミトコンドリアDNAだけでないんだね。
897：小野小町：2017/05/16(火) 19:06:33: 【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、トランスジェニック動物やノックアウト動物のごとき遺伝子改変非ヒト動物を効率的に作成する方法およびこの方法により作成された遺伝子改変非ヒト動物を提供する。そのため、病理学的な研究や新治療法の開発に用いる実験動物の製造、新薬の開発をはじめとする多くの産業分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、倍化４倍体胚の細胞数の解析結果を示す。Ａ－Ｅは１ｘから３ｘ４倍体胚および正常胚（１ｘ２ｎ）をＰＩ染色した写真、Ａ’－Ｄ’は１ｘから３ｘ４倍体胚および正常胚（１ｘ２ｎ）をＣｄｘ２で免疫染色した写真、Ａ”－Ｄ”はそれぞれの写真を合成した写真である。Ａ－Ａ”は１ｘ４倍体胚、Ｂ－Ｂ”は２ｘ４倍体胚、Ｃ－Ｃ”は３ｘ４倍体胚、Ｄ－Ｄ”は正常胚（１ｘ２ｎ）、Ｅ－Ｅ”は３ｘ４倍体胚をＰＩ（Ｅ）、Ｏｃｔ３／４（Ｅ’）で染色した写真、およびその合成写真をＥ”として示した。スケールバー：Ａ”－Ｄ”１００μｍ。Ｅ”２００μｍ。
【図２】図２は、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１を用いた４倍体胚とのキメラ胚の作成を示す。Ａ－Ｃは１ｘ４倍体胚とＥＳ細胞（１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ）のキメラ胚、Ｄ－Ｆは３ｘｘ４倍体胚とＥＳ細胞（１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ）のキメラ胚を示す。Ａ、Ｄは可視光写真、Ｂ、Ｅは蛍光写真、Ｃ、Ｆはそれぞれの合成写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図３】図３は、３ｘ４倍体胚から作出されたＥＳマウスの解析である。（Ａ－Ｃ）ＧＦＰを発現する３ｘ４倍体胚とＥ１４ＥＳ細胞を用いたＥＳマウスである。（Ａ）可視光写真を示す。（Ｂ）蛍光写真を示す。（Ｃ）ＡとＢの合成写真を示す。胎盤においてのみ４倍体胚由来（ＧＦＰ陽性）の細胞が確認される。（Ｄ、Ｅ）フローサイトメトリーによる解析結果である。１ｘ４倍体胚由来のＥＳマウス（Ｄ）および３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウス（Ｅ）の脳（左パネル）および肝臓（右パネル）におけるＧＦＰ陽性細胞の存在頻度を解析した。１ｘおよび３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスともＧＦＰ陽性細胞の存在頻度は１％未満であった。
898：小野小町：2017/05/16(火) 19:07:27: 【出願人】
【識別番号】５０３３５９８２１
【氏名又は名称】独立行政法人理化学研究所
【出願日】
平成２０年１月４日（２００８．１．４）
【代理人】
【識別番号】１０００８１４２２
【弁理士】
【氏名又は名称】田中光雄

【識別番号】１０００８４１４６
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎宏

【識別番号】１００１１６３１１
【弁理士】
【氏名又は名称】元山忠行

【識別番号】１００１２２３０１
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田憲史
【公開番号】
特開２００９－１５９８７８（Ｐ２００９－１５９８７８Ａ）
【公開日】
平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【出願番号】
特願２００８－８９（Ｐ２００８－８９）
899：小野小町：2017/05/16(火) 19:10:25: 以上よ。
900：ドクター・ワトソン：2017/05/16(火) 19:59:22: 顕微授精の件は写真も残されていると手記に書かれているからね。
本当なら裁判で証拠採用されたらもう若山さんはアウトだな。
901：閲覧者：2017/05/16(火) 20:22:40: 根本さんが外堀を埋めたね。
902：一言居士：2017/05/16(火) 20:23:43: マウス裏金疑惑には触れなかったね。
903：在原業平：2017/05/16(火) 20:26:08: 僕はあれでいいと思う。必要な理解は書き切られている。後はいかなる手法で
あったかということだな。
904：小野小町：2017/05/16(火) 20:33:02: あなたイエスの教えに反して約束したわよね。次はTs.Markerさんの問題ね。
神があなたに残りの人生を与えている限りにおいて約束は守ってよ。
905：在原業平：2017/05/16(火) 20:39:14: 釣りの時間を制約しない限りにおいてね。
906：小野小町：2017/05/16(火) 20:46:15: いいわよ。明日にしましょ。

youtube.com/watch?v=UXOYcd6KZ0E
907：自死の自由を！安楽死施設をつくりましょう！：2017/05/17(水) 02:13:45: 自死の自由を！

安楽死施設をつくりましょう！
908：在原業平：2017/05/17(水) 08:00:53: モーニン、小町ちゃん。
909：小野小町：2017/05/17(水) 08:02:15: コーヒーでしょ。
約束よ。
>>
288 ：名無しさん：2017/05/03(水) 17:37:33
3個または4個の4倍体胚にES細胞を移入してキメラ胚を作製する。

13 ：名無しさん：2017/05/04(木) 09:46:19
特開２００９－１５９８７８

701：名無しさん：2017/05/13(土) 10:25:13
ESを持っていれば、マウスを維持し続けなくともF1マウスを好きなときに作出できる。

702：名無しさん：2017/05/13(土) 20:38:12
そのESを指差して、これが怪しい..。と言うこともできる。

703：名無しさん：2017/05/13(土) 23:29:24
20個仮親にいれれば5匹は産まれる。アベレージ20%。アーティクルの4nｷﾒﾗのコントロール実験としてESクローンのデータが載ってる。5匹はちょうどいい数だ。すべて♂になってしまうが。遺伝子の誤差は1%未満。
気にするな、ただの妄想だ。
910：小野小町：2017/05/17(水) 08:03:10: >>
704：名無しさん：2017/05/13(土) 23:55:01
FLSは、1/E CTSは5月。しかし、4月には「僕にマウス」系でコントロールES作成。
コロニーはいつ本当に作られた？
　テクニカルスタッフや小保方さん本人は途中から直接そのコロニーから仔マウスをという証言はあったが、マウスの管理記録はない。
「あの日」には、途中、光る精子でジャーㇺトランスミッション実験を端折ったとある。そして、その後、Acr付ヘテロと判明しているにもかかわらずCTSが作成された。

705：名無しさん：2017/05/14(日) 00:05:08
①TSA処理によるリプログラミングの補助（寺下博論、LeeさんiPs)
②3または4個の胚をくっつける方法
キメラが出来そうな気配だ。

706：名無しさん：2017/05/14(日) 00:21:56
　GLで成功したならば、同様な環境を胚外で目指すな。
ESとのco-culture。GLSやAC129は、相手に駆逐されたのかも。
Tru-Seqのコンタミは「chipはいいが...」のサンプルだろう。
911：在原業平：2017/05/17(水) 08:04:01: なんだい、いきなりかよ。
912：小野小町：2017/05/17(水) 08:05:32: 次はTs.Markerさんの課題について考えてみると言ったわよね。取り敢えず
ここでの書き込みに関してどう思うの?
913：在原業平：2017/05/17(水) 08:12:09: まず特許の件は昨日までに一応お勉強したよな。あれは後の書き込みでTs.Markerさんの示唆と分かるね。
次に701と702は後と繋がってはいるがTs.Markerさんかどうかはっきりしない。独立的に読むと意味のない書き込みだね。
ただ、彼なら何か説明していないことがあるんだろうけど、説明がない以上はコメントのしようがない。
マウスは凍結受精卵でいくらでも保存されていてESなんて使うことはない。人間の体外受精卵も凍結後本人の
体調を安定させてから支給に戻すくらいだ。この二つのコメントはパスするよ。
914：小野小町：2017/05/17(水) 08:14:20: 支給は子宮ね。分かったわ。703からね。
>>
703：名無しさん：2017/05/13(土) 23:29:24
20個仮親にいれれば5匹は産まれる。アベレージ20%。アーティクルの4nｷﾒﾗのコントロール実験としてESクローンのデータが載ってる。5匹はちょうどいい数だ。すべて♂になってしまうが。遺伝子の誤差は1%未満。
気にするな、ただの妄想だ。
915：在原業平：2017/05/17(水) 08:19:39: <20個仮親にいれれば5匹は産まれる。>というところが、昨日までにお勉強した
特許開示書類に書かれていることは分かってるんだから、この書き込み者があの
文書を紹介してくれた人だ。<気にするな、ただの妄想だ。>という書き込みで
これがTs.Marker氏だと分かる。可能性の検討を妄想と自虐的に書くところは
私よりずっと若い人でね、我々にはそういう思考習慣はない。
916：小野小町：2017/05/17(水) 08:30:06: 妄想だと言う言葉でレッテル貼りする幼い反論法がこういうコメント欄に多いんで
その反作用としてTSさんのような自虐的言辞が生まれてくるのね。私たちは
全ての可能性を読みつくそうとしないような知恵遅れは今までここでは叩き
出してきてるからね。可能性の検証を妄想だなんて思わないわよね。
それよりも私が以前書いた質問は<アーティクルの4nｷﾒﾗのコントロール実験として
ESクローンのデータが載ってる。>というところよね。そんな言及はどこにもないから
まずそこがどこか答えて欲しいと既に書いてるわ。
917：在原業平：2017/05/17(水) 08:33:12: 君の質問はまだ全部出し尽くしてないという流れなので返事がないのかな。
でもクローンなんて論文には無いのは間違いないので、ここで、はたと、あれ、
TSさんじゃないのかなと。ふふふ。
918：小野小町：2017/05/17(水) 08:35:36: あれ、そうなの?でも書き込みは続くわね。
>>
704：名無しさん：2017/05/13(土) 23:55:01
FLSは、1/E CTSは5月。しかし、4月には「僕にマウス」系でコントロールES作成。
コロニーはいつ本当に作られた？
　テクニカルスタッフや小保方さん本人は途中から直接そのコロニーから仔マウスをという証言はあったが、マウスの管理記録はない。
「あの日」には、途中、光る精子でジャーㇺトランスミッション実験を端折ったとある。そして、その後、Acr付ヘテロと判明しているにもかかわらずCTSが作成された。

どう考えてもTSさんよ。
919：在原業平：2017/05/17(水) 08:40:55: そうだね。彼の思考を追っている人にはコロニーの有無を問題にしてのが
TSブログだと知っている。ただ、この人はTSさんの疑問を自分のものと同意して
書き込んでいる別人かもしれないね。でも、僕はこれがTSさんだと言う証拠を
持ってるけどね。
それよりもここで彼が重要なことを言ってるよね。
<その後、Acr付ヘテロと判明しているにもかかわらずCTSが作成された。>と。
920：小野小町：2017/05/17(水) 08:44:05: なるほど。これがTSさんだと確定するとコントロールとしてのESクローンデータと
彼が推定しているものが何かと言うことが再び問題になるのね。
先に進むわよ。
>>
705：名無しさん：2017/05/14(日) 00:05:08
①TSA処理によるリプログラミングの補助（寺下博論、LeeさんiPs)
②3または4個の胚をくっつける方法
キメラが出来そうな気配だ。
921：在原業平：2017/05/17(水) 08:46:43: ここが彼がこの特許書類を貼り付けて注意喚起したかったことのようだね。
つまりクローンではなくSTAP細胞を使ってキメラが出来た可能性を示唆している。
922：小野小町：2017/05/17(水) 08:48:36: この件は私たちが先回りして無いと結論付けたわね。ただ、状況と証言ホジュンからの判断で
物証は調べるしかないのよね。
923：在原業平：2017/05/17(水) 08:56:19: 証言ホジュン→証言矛盾　だね。
調べれば分かることはこの文書からも分かったね。ミトコンドリアDNAだけだと
はっきりしない可能性も残るんだけど4Nでもリシピエント胚の分化細胞が1%は
残ると分かった。
TSさんはクローンではないと言う説だからね。
ただ、①も②も普通にntESの達成率の向上手段だよ。キメラはできるよ。当然。
クローン化させてない普通のSTAP細胞を使って出来るかどうかと言う問題とは
別だ。それはsTAP細胞時代の多能性段階の事実が解明されないとどちらだったかは
分からない。でも証言矛盾からの推論でできてたらこんな問題になってないと
いうのが、我々の判断だ。
924：小野小町：2017/05/17(水) 08:58:28: sTAP細胞時代→STAP細胞自体　ね。
>>
706：名無しさん：2017/05/14(日) 00:21:56
　GLで成功したならば、同様な環境を胚外で目指すな。
ESとのco-culture。GLSやAC129は、相手に駆逐されたのかも。
Tru-Seqのコンタミは「chipはいいが...」のサンプルだろう。
925：在原業平：2017/05/17(水) 09:07:23: <「chipはいいが...」>の省略が彼の特徴で、昔からめんどくさがりやで
めんどくさいと自分で書いておられたこともあるくらいで、昔からフォローしている
人間にはすぐTSさんと分かる。これが僕が先に言った本人である証拠だ。

で、<GLで成功したならば、同様な環境を胚外で目指すな。>のところ、そもそもGLは
胚外で作るんだよ。キメラ胚ってインジェクションでも集合法でも培養してESを作る。
子宮に戻すのは胎児を作るときだ。<ESとのco-culture。>というのはDORAさんと
議論していたところだけど手法に誤解があるんじゃないかな。co-cultureというのは
別の概念だ。この辺り彼の考察も曖昧だと思うよ。<GLSやAC129は、相手に駆逐されたのかも。
Tru-Seqのコンタミは「chipはいいが...」のサンプルだろう。>の部分はその曖昧な推定の流れのままに
ボンヤリとイメージされているんじゃないかな。
926：小野小町：2017/05/17(水) 09:10:53: <相手に駆逐されたのかも>というところが彼のブログの緑に光る細胞塊が写真上下から
せり出してくるやつね。それは後でやるんでしょ。約束だわよね。
で、結局ここに書き込まれた中で気づかされたのは<その後、Acr付ヘテロと
判明しているにもかかわらずCTSが作成された。>と言うところね。
検討してよ。
927：閲覧者：2017/05/17(水) 09:12:47: 体外ではないよ。胚外だ。
928：在原業平：2017/05/17(水) 09:21:42: あっ、そうか。また意味が違ったか。でもいいよ。そのことは後で彼のブログに
残されている問題を検討するときにもう一度やろう。
それよりもここではアクロシン問題をかたづけよう。
まずCTS-1は2012/5/25樹立開始、CTS-11-13が2012/7/9樹立開始だ。
929：孤舟：2017/05/17(水) 09:25:13: 悪友から電話だ。
930：小野小町：2017/05/17(水) 09:26:49: ふ、グッドラック。

youtube.com/watch?v=ov1hRqPnm58
931：酔狂：2017/05/18(木) 01:32:11: 先生、特許について盛り上がってるブログがあるようなので、そちらの原稿もとりいそぎお願いします。

あー、先生の悪友は電話魔らしいので、本日編集会議の方針により、アパホテルの電話のない部屋に美女接待漬けにして軟禁しました。
932：自死の自由を！安楽死施設をつくりましょう！：2017/05/18(木) 02:22:42: 自死の自由を！

安楽死施設をつくりましょう！
933：在原業平：2017/05/18(木) 19:12:55: 小町ちゃん、ジンライム頂戴。
934：小野小町：2017/05/18(木) 19:15:00: あら、オーナーさん。スナック時間に見えるのも珍しいわね。また、出版社の方が見えて
原稿の督促だわよ。
935：在原業平：2017/05/18(木) 19:17:05: へえぇーーーっ、あいつそんな羨ましいところに軟禁されてたのか。どうりで
電話しても出ないはずだ。携帯も取り上げられていたのか。
936：小野小町：2017/05/18(木) 19:18:04: 今日どこ行ってたの?
937：在原業平：2017/05/18(木) 19:19:36: 悪友から朝早く電話があってね。午前中一緒に釣ってた。
938：小野小町：2017/05/18(木) 19:21:26: え、どういうこと。悪友さんは編集者さんが軟禁したとおっしゃってるわ。
939：在原業平：2017/05/18(木) 19:32:06: ああ、今日電話して出なかった奴ね。あいつは佐平治っていうんだ。デエクだよ。
もう半年はそのホテルから出ねエぞ。下手したらいつの間にかクラークやってるかもね。
俺たちの仲間は釣りの秘密クラブさ。なんとかプレミアクラブと言ってね。
ホントの名称は言えないけどね、一応、互いに名人と認められない限り入れない。
クラブだ。メンバー数は８人なんだよ。いつも同じ奴から電話が来てるわけじゃない。
940：小野小町：2017/05/18(木) 19:34:20: あなち、時々業務連絡入れるのって広報だったのね。
941：在原業平：2017/05/18(木) 19:36:50: あなちって言わないでね。小町ちゃん。一緒に飲んでくれるのはありがたいが、
もう呂律回ってないぞ。ア・ナ・タって言ってごらん。
942：在原業平：2017/05/18(木) 19:40:02: まあ、株主さんだからロハで飲ませてあげようと思ったけど今日はお勘定いただくわ。
943：小野小町：2017/05/18(木) 19:42:42: あら、御免なさい。名前間違えた。でも、この文章の前の形で禁止ワードに
触れるのよね。何が禁止ワードかなかなか分からないのが面白いわね。それで
その都度名前がもとに戻っちゃうのね。
944：在原業平：2017/05/18(木) 19:47:08: そんなことはどうでもいいんだけど、今日も一応僕のお気に入りブログはチェックしたけど、
特許で盛り上がってるブログなんて知らないぞ。
僕は今は和モガさんがどう全体を整合させて来るかにしか興味ない。
945：小野小町：2017/05/18(木) 19:50:12: 和モガ=佐藤さん。DORAさんは佐藤さんの本が出た時、その攻撃の不徹底に関して
佐藤さんを擁護したから、本人が佐藤さんでは無い筈だと思ってるのね。
946：在原業平：2017/05/18(木) 19:56:50: 和モガさん---DORAさん---Ts.Markerさん---
ooboeさんとそのパートナーとされている人---
気まぐれ先生---木星さん

まあ、この辺りは一応ひとくくりで考えている。
947：小野小町：2017/05/18(木) 20:00:49: 誰が誰で、どういう関係かなんてことには一切興味がないけど、この問題に関する
解の仮説に呼び名を与える関係上、言い出しっぺの名前を冠するのが分かりやすいので
区別したいなと思っているだけなのね。
948：在原業平：2017/05/18(木) 20:05:46: ははは、まあ、そうなんだけど、彼らはほぼ同時に同じようなことを
書き始めるんでそれもそう簡単な識別にはならないんだけどね。
949：小野小町：2017/05/18(木) 20:09:05: 今日のお気に入りチェックでは救う会で匿名希望HNが語ってるわね。
950：在原業平：2017/05/18(木) 20:13:01: こういう書き込みというのは一般に人々は今書き込まれていることを読むんだよ。
スピン屋は金もらてやってることだからね。一段落したらまた同じ問題を蒸し返すのさ。
楽でしょ。まあ、聞き流してればよろしい。どうせアホだ。
それよりも和モガ氏の全体整合の仕事を待とう。
951：小野小町：2017/05/18(木) 20:18:59: アメリカではちゃんと若い人たちに受け継がれていくものがあるのね。
日本はもっと歴史が長いんだけど最近どうかしたんじゃないのかしらね。
アパホテルに置かれてる本ちゃんと読んでるのかしら。

youtube.com/watch?v=HFGsRJM_4bs
952：自死の自由を！安楽死施設をつくりましょう！：2017/05/19(金) 03:42:12: 自死の自由を！

安楽死施設をつくりましょう！
953：在原業平：2017/05/19(金) 06:12:50: モーニン。小町ちゃん。コーヒーね。
954：小野小町：2017/05/19(金) 06:18:41: 今日も出かけるのね。
955：在原業平：2017/05/19(金) 06:20:59: もちろんさ。ところで、小町ちゃん、昨日のジャズシンガーはスパニッシュなんだぜ。
956：小野小町：2017/05/19(金) 06:23:28: あら、そうだったの。きれいな英語で歌うのね。あの子はトランペットがすごいわね。
よく歌ってるわ。
957：在原業平：2017/05/19(金) 06:32:47: 教育は大事だね。諏訪内晶子も天才教育されてああなってるからな。
でもちゃんと素質を見抜く人も必要だ。佐平治をアパホテルに軟禁しても
南京事件の真実には目が向かないよ。みんな持ってる才能が違うからな。
現在の価値観に合う才能に生まれついてる人は得だね。でも、もうすぐ核戦争に
なるみたいだから、これからは放射線に強く生まれついている人達だけが
生き残るのかもしれないね。そのときは残念ながら諏訪内晶子には生き抜く
天才が与えられていなかったという嘆きになるんだろうね。多様性は必要だよ。
958：小野小町：2017/05/19(金) 06:38:56: 北のバカ面野郎は早く始末しないといけないわね。私、放射能には強く生まれついていないのよ。
困るわ。こっちの天才を持つ人は日本人には少ないでしょ。ヨーロッパには一部居るらしいわね。
でも、人類の先々の生存を保証するにはそういう選ばれた人々に期待するより
あのアホ金野郎を殺しちまった方がコストが安いわ。犠牲は一人で済む。だれでもこっち選ぶでしょう。
959：在原業平：2017/05/19(金) 06:41:57: ホントだね。まあ、誰しも考えることは同じだからいずれそうなるでしょ。