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STAP問題の全解に向けて
ここは広くていいぞ。
欲でしょ。ちょっとした嘘のつもりが周りを巻き込んでしまって身動きできなくなって
結果的にねつ造論文になってしまった。そのちょっとした嘘は他愛のないことだったはずなんだが
人ひとり自決すると言う悲惨な結果になってしまった。
山梨で一大プロジェクトという夢を見たのね。どうもそれが全ての原因かな。
その底流には転勤と言う予想される環境の激変による精神の不安定化、そして同業の
山中氏のノーベル賞受賞に対するショック、更には東北震災という日本全体の精神の
不安定化も影響していたところに小保方さんの細胞が輝いて見えたと言うことがあるんでしょ。
笹井さんにもそれが当てはまるかもしれないね。
その他愛ない筈の嘘は裏にとても深い事情を秘めてたんでしょ。彼が考えているほど
単純な事情ではなかった。彼女の細胞はヴァカンティの悲願でもあったんだな。
共同研究協約書を開示してもらいたいね。
訂正
>>
824 :在原業平 :2017/05/16(火) 14:51:10
2と3は①しかない。
↓
2と3は②しかない。
小保方さんの細胞は自然の不可思議の尻尾を掴んだものかもしれないね。
でも、あの実証では人を納得させることはできないから、これからもっと厳密な研究を
進めなければならないね。
キメラができたのは野依さんの言ったように若山さんの名人芸によるんだね。
彼も別にねつ造論文で世間を驚かそうなんて思ったはずもないんでね。そもそも
受賞歴もある人だよ。ただ、小保方さんの細胞をヴァカンティから奪い取ろうとしたというより
自分と研究した方が生産性が高いと勝手に思い込んで、ちょっとした嘘で彼女を
誘い込もうとしたが、それは彼が舞い上がっていて、冷静さを欠いていたんだね。
彼女の細胞はハーバードの発見に帰属している。それを安易に受け止めていたんだろうな。
あなたのストーリーではやはり春頃の特許での米側との確執のころから
逃げ道をこしらえていたと?
論文受諾までは何とかリジェクトされないかと期待していたがとうとうアクセプトされてしまって
もはやこれまでとタイミングを見てあらかじめ用意していた「僕のマウス」ストーリーを語り始めたと。
8月の責任著者を降りたいと言った頃、笹井さんに何かしら仄めかそうとしたが
笹井さんは聞く耳持たなかったということかな。はっきりと言うわけにもいかないからな。
中途半端なことを言って、笹井さんは笹井さんで論文を通すことが自分の仕事であり、出世への
道だからね。若山さんがあれはクローンだよとでも言わない限りは、そんなことはラボの
ミーティングテーブルの上で検討すべきことだと言ったというのもむべなるかな、かな。
あなた方は嘘をついているという意味での若山さん犯人説は動かないのね。
ただ、どんな手法であったか。どんな経緯であったかと。
そうです。大逆転があるとしたらペンディングしているテラトーマ問題に関して
致命的なミッシングリングの暴露があったときでしょうかね。
和モガさん達のこだわっている論文通りにキメラが出来ていた可能性はないと。
それは物証が確認されていないので何とも言えないことではあるんですが
まず、できてたらこんな問題にならないでしょうと言う自然な疑念への回答が要る。
もう一つは出来ていたのに隠しているというそのことが既に小保方さんへの犯罪になる。
犯罪と知ってあれはねつ造だと若山さんが騒いでいるというのですか。
論文通りにできてないと言って皆の反対を押し切って若山さんが取り消したんでしょ。
では第三者かと言うと、どうして二人の間に致命的な対立があるんですか。かたや、
光る精子で顕微授精してたと証言し、かたやなんでアクロシンマウスが使われているのか
分からないと言ってる。どっちかが嘘ではないですか。第三者はない。
でも、キメラはできてる。なんでか。クローンしか考えられないと。
小保方さんが何らかの方法で太田ESを手に入れてコンタミしたか、さもなければ
小保方さんは何もしないが、若山さんがクローン技術を使ってキメラを作った
という二者択一なのね。その間のグラデーションはないと。結構つらい選択よね。
それが人々を砂漠のダチョウにしていると。
若山さんがSTAP幹細胞のジャームライン確認でなくても「光る精子」を
顕微鏡下で見ていただけでアウトだね。なにしろ彼は「僕のマウス」を
渡したことになっていて、光る精子なんて知らないはずなんだからね。
彼の記者会見見たでしょ。問題は手記記述が事実であると言う証拠だ。
あの時点では彼は「光る精子」を見ていてはいけないわね。だって「僕のマウス」を
渡したと言ってるんだから。それ以前には何度でも見ていたことは分かり切ってる。
4Nキメラがヘテロでしかもテラトーマにアクロシンがあったというのは渡したマウスが
岡部マウスであったかさもなければ小保方さんが太田ESを使ったかだね。
若山さんは一回目が「僕のマウス」ではなかったことを記者会見で言ってないね。
なぜ黙っていたか。
一回目は「僕のマウス」ではないが二回目は「僕のマウス」だと言うと、
一回目のマウスと二回目のマウスと間違えただけだと思われやすいよね。
それを防ぐためには一回目のことは黙っていた方がいい。現に大半の人たちが
一回目も「僕のマウス」だと思い込んでいたでしょ。和モガさんですらそうだ。
刷り込み効果なんだよね。桂報告を良く吟味して初めてヘテロだと証言していた
と言うことが分かる。まして、記者会見の時桂報告は出てない。
小町ちゃん。男言葉になってる。ははは。
このジャームライントランスミッション実験の時に若山さんはまだ逃げの準備をしてなくて
迂闊にも「光る精子」で顕微授精してるんだよと小保方さんに説明してたのを
日記につけられてたかな。
日記はいくらでも嘘はかけるから証拠にはならないけど、若山さんが
最初の実験でヘテロマウスを使って二度目は「僕のマウス」だったという
説明で一度目のマウスに関して黙っていたというのは事実だ。それを
同捉えるかと言う問題だね。そういうのが一つ二つでないとこれも傍証として
効力を発し始めるね。例えば李ESは関係ないということも、盗まれたものでないと
言うことも彼は告発時に黙っていた。
小保方さんが犯人なら太田ESらしいものが小保方さんのフリーザーに残されていることに
不思議はないんだけど、小保方さんがコンタミ犯でないのに彼女のフリーザーに太田ESらしきものが
あったら、誰かが置いたと推測するのが自然だわね。
その問題が木星さんグループの共通した問題意識です。救う会の発端はここです。
和モガさんがその問題を一番最初に解決したんじゃなかったかな。あれは
太田ESでなくてFLSだと言うことでしょ。近親率がおかしいと初めて指摘した。
我々も木星リストで小保方さんがFLSだと言っていることを指摘している。
木星リストには
FLS→129ESと書いていた
とあって、
129GFP+-について
FLSのことだろうとあるわね。
小保方さんは自分が書いたとしていて、かつFLSだと思っているらしいわね。
少なくとも文字を見て自分のものでないとは疑義してないね。
桂報告はその中身を調べて太田ESだとした。
うん。それを和モガさんはFLSだと言った。
桂報告がそれを太田ESだと言ったのは渡したマウスを「僕のマウス」だと
若山さんが言って、かつそこから出ない筈のアクロシンが出たからだね。でも、
我々はそれは最初から岡部マウスとのF1を渡していたと解したんだね。
若山さんの嘘だと。FLSはそもそもアクロシンが出て当たり前なのだと。
ならば、和モガさんの言うようにそれはFLSでおかしくない。
一回目のF1マウスは「僕のマウス」ではなく、かつテラトーマからアクロシンが
出ている。
彼は途中から逃げる算段として「僕のマウス」論による言い逃れを準備したという
あなた方の説ね。でもすぐには逃げる必要はなかった。なにしろ論文がリジェクトされている
現象でこれが世間での騒ぎになることはないからよね。
しかし、桂報告後、再現実験終了後に彼らは自ら小保方攻撃としての石川告発を
行った。なぜか。
野依理事長の言葉だろうね。限りなく小保方を仄めかしながら桂報告は
犯人不詳とした。しかし、野依さんは去り際に未熟な小保方といい、名人芸の若山さんが
キメラを作ったと言った。
彼はねつ造した研究者が悪いんで管理の問題ではないから辞任の必要を
感じないとしていたんで、悔しかったんでしょうね。知ってるぞと言いたかったのね。
でも警察入れようと思えば入れられたわけでしょ。でもそうしなかった。
痛い腹もあったんでしょうね。
日本も欧米と同じように警察を入れるべきだ。はっきりさせないといいことないよ。
そろそろ本題の続き頼むよ。
【0012】
また、本発明に用いられる4倍体胚は、1種類のみの胚から作成されてもよい。1種類の胚は、例えば、前記のようにIVFまたは交配により作成される2細胞期の胚を含んでよいが、それらだけに限らない。所望により胚の融合は前記の方法と同様に行ってもよい。
【0013】
次いで、4倍体胚をディッシュなどの適当な容器に入れ、ES細胞を移入し、培養してキメラ胚を作成する。4倍体胚をホストとしてES動物を作成する際に、一般的には、1個または2個の4倍体胚が使用されている(非特許文献2および3)。本発明における4倍体胚の個数は、好ましくは3個または4個であり、最も好ましくは3個である。本発明において、3個の4倍体胚をホストとしてES動物を作成する場合には、1個または2個の4倍体胚を用いる場合に比較して、目的とするES動物の作成効率が2.5〜8.5倍程度上昇する。一方、5個またはそれ以上の4倍体胚を用いる場合には、ES動物の作成効率は3個または4個の場合より低下する。また、本発明で用いられる4倍体胚の発生時期は、電気融合直後の1細胞期以上であってよく、好ましくは、2細胞期から柔実胚期までである。最も好ましくは、4倍体胚の発生時期が2細胞期または4細胞期である。本発明では、4倍体胚を適当な容器に入れる前に、アシッドタイロード溶液などの当業者間で一般的な溶液を用いて透明帯を除去してもよい。本発明において、ES細胞の移入工程でディッシュを用いる場合には、当該分野で一般的に用いられるものであってよく、例えば、プラスチックディッシュを用いてもよい。その場合において、好ましくは1ウェルごとに小さな窪みを作成し、ES細胞の移入の際に4倍体胚を支持できるようにすることにより作成効率を向上させることができる。従って、本発明は、このような4倍体胚を支持できる窪みを有する容器、ならびに該容器を必須構成成分として含むES動物作成用キットなども提供する。
集合キメラの作り方だけど、4N胚を3個というのが特許発見で、これで達成率が1割から2割にまで
上がると主張しているわけだね。
【0014】
本明細書で用いられる「ES細胞」は、胚盤胞期の受精卵の内部細胞魂(ICM)に由来する、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞を意味する。これまで、ホストとして4倍体胚を用いる効率的なES動物の作成においては、樹立されたF1由来のES細胞が使用されている(非特許文献4)。しかし、本発明では、ES細胞はあらゆる種類のものであってよく、当業者間で一般的に用いられるものを適用することができる。例えば、E14、R1またAB-1などの129系統に由来する細胞株、あるいはTT2などの市販されている細胞株を含むが、これだけに限らない。また、本発明で用いるES細胞は、近交系または交雑系に由来する上記のごとき一般的なES細胞株であってよく、好ましくは近交系に由来するものである。本明細書で用いられる「近交系」とは、20世代またはそれ以上にわたり兄妹交配が行われてきた系統のことをいう。また、129B6F1G1、BDmt2またはDFC3Hのごとき核移植胚由来のES細胞(ntES細胞)を本発明の方法に用いることができる。これらのntES細胞は発明者らの研究室にて樹立された。ここで、129B6F1G1はGFPを発現する129B6F1系統のセルトリ細胞であり、BDmt2はBDF1系統の繊維芽細胞を用いた核移植胚由来のntES細胞であり、ならびにDFC3HはC3Hの脳細胞から樹立した近交系に由来するntES細胞である。
<129B6F1G1はGFPを発現する129B6F1系統のセルトリ細胞>とあるのは
精巣の細胞なんでアクロシンGFPなんだね。太田さんの論文何だから無論岡部マウスだよね。
【0015】
さらに、本発明に用いられうるES細胞は、ES細胞に類似した性質(本発明でドナーのES細胞として用いることができる性質)を有する細胞であってもよく、例えば、人工多能性幹(iPS)細胞などを含むが、それだけに限らない。
2008年から2009年にかけての特許申請だよね。
IPSは2006年の成功で2012年のノーベル賞受賞だね。
無論小保方STAPでもいいわけだよな。
もっともこれはできなかったと見てるが。出来ていたと言う人たちは
論文通りではないがこれも考えるのかな。
【0016】
また、本発明に用いられるES細胞において、特定の遺伝子が導入されているか、または特定の遺伝子がノックアウトされていてもよい。
【0017】
ES細胞を適当な条件で培養してから、4倍体胚に移入することができる。ES細胞の培養は、当該技術分野において一般的な方法を用いて行われてよい。例えば、基本培地として、KNOCKOUT(登録商標)DMEM(Invitrogen, CA, USA)を用いてよい。また、添加物として20%胎児ウシ血清(Sigma-Aldrich, MO, USA)、白血病抑制因子(LIF)(1000ユニット/ml,Invitrogen)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(invitrogen)、1%L-グルタミン(Specialty Media, NJ, USA)、1% 非必須アミノ酸(Specialty Media)、1% ヌクレオシド(Specialty Media)、または1% β-メルカプトエタノール(Specialty Media)を添加して培養したものであってよい。
【0018】
また、本発明では、ES細胞の培養は、ゼラチンでコートしたディッシュ(フィーダー細胞非存在)上で行われてもよい。
【0019】
本発明では、4倍体胚に移入されるES細胞の数は、1個以上であってよい。また、4倍体胚に移入されるES細胞の数は、好ましくは8〜15個である。移入されるES細胞は細胞塊として移入されてよい。本発明における移入は、例えば、ES細胞を4倍体胚に接触させる、あるいは注入することによって行ってもよい。これらの操作は、顕微鏡またはマイクロマニピュレータを使って行われるのが一般的である。
0019の<あるいは注入することによって行ってもよい。>というのはインジェクションで
3個の4倍体胚を使うというのとちょっと違ってないかな。どうせ説明してくれる専門家もいないんだろうけどね。
ど素人の悲しさだね。
【0020】
本明細書で用いられる「キメラ胚」は、由来の異なる2個以上の胚由来の細胞の結合により得られた胚を意味する。本発明に用いられうるキメラ胚は、好ましくは3個または4個の4倍体胚にES細胞を移入して培養した胚である。キメラ胚の培養は、例えば、CZB培地にて約24時間行われてよい。これらの条件は当業者が適宜定めうる。
好ましくないのがインジェクションということなのかな。特許独特の定義なのかな。
【0021】
次に、3個または4個の4倍体胚にES細胞を移入し、適当な条件で培養することにより得られたキメラ胚を偽妊娠非ヒト動物に移植して、子供を産ませ、ES動物を得る。キメラ胚を、偽妊娠非ヒト動物の卵管内または子宮内に移植してもよい。偽妊娠非ヒト動物は、ES細胞が由来する動物と同種の動物であればよく、系統が異なっていてもまたは同一であってもよい。例えば、偽妊娠非ヒト動物は、偽妊娠2.5日目のICRマウスであってもよいが、これだけに限定しない。本発明で用いられるキメラ胚の移植は、当業者間で一般的に用いられる方法によって行われうる。次いで、当業者間で一般的な方法に従って仮親(キメラ胚を移植された偽妊娠非ヒト動物)を飼育し、出産させてES動物を得ることができる。
ここは誰でも分かるよ。
【0022】
前記のごとく、3個または4個、とりわけ3個の4倍体胚をホストとしてES動物を作成すると、従来の方法と比較して作成効率を高めることができる。また、この本発明の方法では、あらゆるES細胞が使用でき、例えば近交系由来のES細胞でも使用可能という利点を有する。さらに本発明の方法により得られたES動物は、奇形頻度が従来のESマウスと同程度であり、十分に実用に供することができる。
なるほど、そうですか、と。
【0023】
次に、下記の実施例に用いた主な材料および方法を示すが、本発明を限定するものではない。
【0024】
使用したマウスおよびES細胞
BDF1およびICRマウスはSLC(浜松、日本)から購入し使用した。ICRバックグラウンドのGFPトランスジェニックマウスはpCAG-EGFPをベクターとして以前発明者らの研究室で樹立したものを使用した。使用したES細胞は4種類で、一般的なES細胞としてE14(Hooper M, Hardy K, Handyside A et al. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature 1987;326:292-295)、核移植胚由来のES細胞(ntES細胞)として、129B6F1G1、BDmt2およびDFC3Hを使用した。E14は、1985年にMartin Hooper博士(Edinburgh, Scotland)らにより樹立され、Peter Mombaerts博士(Rockefeller University)が培養・保存していたものを分与して頂いた。129B6F1G1は、GFPを発現する129B6F1系統のセルトリ細胞、BDmt2はBDF1系統の繊維芽細胞を用いた核移植胚由来のntES細胞で、以前発明者らの研究室で樹立されたものを使用した。また近交系由来のntES細胞として、C3Hの脳細胞から樹立したntES細胞(DFC3H)を10株ランダムにESマウスの作成に使用した。
【0025】
ES細胞の培養条件
ES細胞の培養は一般的な条件に従って行った。基本培地としてKNOCKOUT(登録商標)DMEM(Invitrogen, CA, USA)を用い、下記の添加物を加えたものを培養液として使用した:20%胎児ウシ血清(Sigma-Aldrich,MO,USA)、白血病抑制因子(LIF)(1000ユニット/ml,Invitrogen)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(invitrogen)、1% L-グルタミン(Specialty Media, NJ, USA)、1% 非必須アミノ酸(Specialty Media)、1% ヌクレオシド(Specialty Media)、1% β-メルカプトエタノール(Specialty Media)。ES細胞はゼラチンコートを施したディッシュ上においてフィーダー細胞非存在下で培養した。
動物実験申請書にあるマウス購入業者の黒塗りの下にはSLC(浜松、日本)も
ありそうだね。ここに裏金蓄積があつたりして。E14なんてESも保存しているのね。
譲ってもらったんだから今でも大事に保管してるでしょうね。太田ESだって保管して
いるはずなんだけどね。
野依さんも痛い腹はあったんでしょうねえ。
ま、ま、そこは別問題として。
【0026】
4倍体胚の作成とESマウスの作成
本実験で使用した4倍体胚は2種類の胚から作成した。1つはBDF1の精子と卵子を顕微授精(IVF)させた胚(BDF2)であり、もう1つはICRGFP雄とICR雌を交配させた胚を使用した。後者の胚(ICRGFP)ではGFPを発現するため、4倍体胚に由来する細胞の存在を緑色蛍光により確認できる。IVFは一般的に用いられている方法を用いて行った。具体的には、BDF1マウスの精巣上体尾部から精子を回収し、TYH培地(Toyoda Y, Yokoyama M, Hoshi T. Studies on fertilization of mouse eggs in vitro: I. In vitro fertilization of eggs by fresh epididymal sperm. Jpn J Anim Reprod 1971;16:147151)にて培養した。卵子は過排卵処理を施した雌BDF1から採取し、TYH培地を用いて培養した。ここに精子を1x105細胞/mlになるように添加することによりIVFを行った。IVF後、授精した胚を回収し、2細胞期胚を得るため、CZB培地(Chatot CL, Ziomek CA, Bavister BD et al. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 1989;86:679-688)において24時間培養した。一方、ICRGFP胚を得るためには、過排卵処理を施したメスICRと、オスICRGFPマウスを一晩交配させた。翌朝、交配を確認し、その24時間後に卵管を採取し、2細胞期の胚を回収した。BDF2およびICRGFPの2細胞期の胚を、電気融合装置(Model LF101、ネッパジーン(株)、千葉)を用いて電気融合させ、4倍体胚を作成した。電気融合に成功した胚を選別し、CZB培地にて一晩培養した。
小保方さんが理研に来る前にこのラボではこんなことをしてたんだねエ。
小保方さんがきてからも彼が顕微授精してたのを見たんだね。嘘でなければ。
見てもないことを空想で書くって、まずそれを思いつくことが大変だろうね。
もっともこんなふうな論文を読んでいれば創作は可能かも知れないが。
【0027】
2〜4細胞期に発生した4倍体胚を選別し、アシッドタイロード溶液を用いて透明帯を除去した。次いで、プラスチックディッシュ上に作成した小さな窪みに、1個(1x)から3個(3x)の4倍体胚を入れた。さらにその上から8〜15個のES細胞の細胞塊を入れることにより、ES細胞と4倍体胚のキメラ胚を作成した。CZB培地にて24時間培養後、得られたキメラ胚を偽妊娠マウス(偽妊娠2.5日目)の子宮内に戻した。これらのマウスを妊娠18日目で帝王切開し、産仔の有無を解析した。
集合キメラができました、と。
【0028】
胚盤胞期胚の細胞数の解析
胚盤胞期の細胞数を数えるため、ヨウ化プロピジウム(PI)染色およびCdx2の免疫染色を行った。PIでは全ての細胞が染まるため、全細胞数の指標として使用し、抗Cdx2抗体では栄養外胚葉(TE)細胞のみが染まるため、TE細胞の細胞数の指標として使用した。細胞内部魂(ICM)の細胞数を、全細胞数(PI陽性細胞)からTE細胞数(Cdx2陽性細胞)を差し引いた細胞数として計算した。具体的には、1xから3xの4倍体胚を胚盤胞期まで発生させ、4%パラホルムアルデヒドを用いて固定し(室温で45分間)、PBSで3回洗浄後、抗Cdx2抗体(1:200; BioGenex, CA, USA)を室温で1時間反応させた。PBSで3回洗浄後、2次抗体(goat anti-mouse IgG conjugated with Alexa Fluor 488; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)と室温で30分間反応させた。PBSで3回洗浄後、1μg/mlのPI溶液に移し、共焦点顕微鏡を用いてそれぞれの胚盤胞期胚を撮影した。細胞数のカウントには、焦点写真をMetaMorph software(Universal Imaging Co., Downingtown, PA, USA)を用いて立体構築し、PI陽性細胞数およびTE陽性細胞数をカウントした。この解析には、正常胚(1x2n)および1xないし3xの4倍体胚に由来する胚盤胞期の胚をそれぞれ10個ずつ使用してカウントした。
細胞数のカウントしたことが無いなんて言ってた人居なかったかな。それに染色も
小保方さんに任せなくても自分たちでできるんだし、パラフィンブロックも作れるのね。
ははは、博士さん達なんだから当たり前だよね。当たり前でないのはやったことないなんて
言ってることのほうだよねえ。
はっはっは。白々しいにもほどがある。
【0029】
新生仔ESマウスの解析
ESマウスを妊娠18日目で帝王切開し、体重、胎盤重量の測定、および奇形(腹部ヘルニア、開眼、巨大産仔)の有無を観察した。また、ホストとしてICRGFPの4倍体胚を用いた実験では、ESマウスにおいて4倍体胚由来の細胞の有無を調べるため、ESマウスの肝臓および脳組織を用いてフローサイトメトリーを行った。具体的には、新生仔ESマウスから肝臓および脳を摘出し、ハサミで細切後、0.25%トリプシン-EDTA溶液で培養した(37℃で15分間)。10%FBSを含むDMEMを等量添加後、遠心分離し(300gで7分間)、上清を捨てた後、PBSで同様に2回洗浄した。細胞を10%FBS含有のDMEMに懸濁し、フローサイトメトリーに使用した。フローサイトメトリーにはFACSaria(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)を用い、それぞれの組織における主要細胞群を側方散乱(SSC)および前方散乱(FSC)を指標として同定した。主要細胞群中のGFP陽性細胞数を測定することにより、4倍体胚由来の細胞を同定した。
これは基本的には太田さんの実験なんだけど若山さんがボスだからね。若山さんが
フローサイトメトリーのやり方を知らないと言うことは考えられない。しかし、
手記には小保方さんが若山さんにセルソーターの機械の使い方を教えてあげたというくだりがあるね。
若山さん小保方さんの程度を試していないかな。
95Pだね。あの下りは細胞の作り方を盗もうとしているとも見えるところだな。
【0030】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例】
【0031】
A.倍化ESマウスの出産率の比較
本実験の目的は、複数の4倍体胚を用いることによりESマウスの作成効率の向上を図ることである。そのためにまず、正常胚を用いて、倍化胚(3xおよび5x)を作成し、その発生能を解析した。その結果、3x正常胚では正常な範囲内で産仔を得ることに成功したが(50%;8/16)、5x正常胚からは産仔を得るにいたらなかった(0%;0/8)。以上の結果から、過剰な胚の数は発生能を障害することが示唆された。この結果を元に本実験では1xから3xの4倍体胚とES細胞のキメラ胚を作成し、ESマウスの出産率を比較検討した。
なるほど。
【0032】
B.倍化4倍体胚の細胞数の解析
ESマウスの作成の前に、まず、倍化した4倍体胚の細胞数が実際に増加しているのかを検討した。授精後96時間の1xから3xの4倍体胚をそれぞれ10個ずつPIとCdx2の2重染色を行った。以前の報告(Koizumi N, Fukuta K. Preimplantation development of tetraploid mouse embryo produced by cytochalasin B. Exp Anim. 1995;44(2):105-109)と一致して、1x4倍体胚では正常胚(1x2n)と比較して総細胞数の減少が認められた(表1および図1A-A”、D-D”)。一方で、2x4倍体胚および3x4倍体胚では、総細胞数の増加が確認された(表1および図1B-B”、C-C”)。これらの2x4倍体胚および3x4倍体胚では、TE細胞数およびICM細胞数もそれぞれ増加していることが示された(表1)。また、3x4倍体胚を抗Oct3/4抗体で免疫染色したところ、正常にICM細胞が染色された(図1E-E”)。以上の結果から、胚盤胞期の倍化4倍体胚では、予想通り細胞数が増加しており(表1)、ICMなどへの分化も正常に行われることが証明された(図1E-E”)。
(表1.倍化4倍体胚の細胞数の解析)
【表1】
あら自分で貼り付けたの?
【0033】
C.倍化4倍体胚を用いたESマウスの作成効率の検討
先の実験で倍化4倍体胚の細胞数の増加が確認されたので、次にESマウスの作成効率の検討を行った。使用したES細胞は、一般的なES細胞株であるE14、ntES細胞として129B6F1G1(GFP陽性)およびBDmt2、ならびに近交系由来のES細胞株としてDFC3H(合計10株をランダムに使用)を用いた。図2に示したように、GFPを発現する129B6F1G1を用いてキメラ胚を作成したところ、3x4倍体胚にES細胞が正常に取り込まれることが示された(図2D-F)。
【0034】
次に、各ES細胞と1xないし3xの4倍体胚とのキメラ胚を作成し、胚移植後の発生能の検討を行った。1xおよび2x4倍体胚をホスト胚として用いた場合では、3系統のES細胞(E14、129B6F1G1およびBDmt2)は、ESマウスの作成効率が約1-3%と非常に低頻度であった(表2)。一方、3x4倍体胚を用いた場合では、その作成効率が約2.5-8.5倍に向上した(8.6%:表2)。また、従来作成が困難と考えられていた近交系由来のESマウスでも、3x4倍体胚を用いることにより約7%の成功率で作成可能であることが示された(表2)。
【0035】
以上の結果から、2x4倍体胚では正常胚と同程度の細胞数を有するが(表1)、ESマウスの作成効率は、3x4倍体胚を使用したものが最も効率がよく(表2)、従来法の1xもしくは2x4倍体胚では不十分であることが示された。
(表2.倍化4倍体胚を用いたESマウスの作成効率の検討)
【表2】
なるほど。
*:E14;一般的に用いられているES細胞。129B6F1G1およびBDmt2;ntES細胞。DFC3H;近交系由来ntES細胞。
【0036】
D.倍化4倍体胚より作成された新生仔ESマウスの解析
ESマウスは奇形仔の頻度が高いことが知られているので、次に3x4倍体胚より作成されたESマウスの表現型を観察した。3x4倍体胚由来のESマウスは、体重・胎盤重量とも1xまたは2x4倍体胚由来のESマウスと同程度であった(表3)。また開眼・腹部ヘルニア・巨大産仔の出現率なども差は認められなかった(表3)。以上の結果から、3x4倍体胚を用いた場合であってもESマウスの奇形頻度は、少なくとも従来のESマウスと同程度であることが示された。
奇形が多いんだね。でも今までとたいして変わらない頻度なんだから達成率の高さが自慢だと。
【0037】
ESマウスの最大の特徴は、体を構成しているほぼ全ての細胞がES細胞由来であるという点である。表1に示したように、3x4倍体胚では、総細胞数のみならず、体を構成しうるICM細胞も増加している。最後に、3x4倍体胚由来のESマウスが実際にES細胞由来の細胞で構成されているかを検討した。
【0038】
ホストである4倍体胚由来の細胞とES細胞を区別するため、ES細胞にはE14、ホストにはICRGFP由来の4倍体胚を使用した。このことにより、4倍体胚由来の細胞がGFPを発現するため、ESマウスにて4倍体由来の細胞を容易に確認することが可能となる。この方法を用いて、3x4倍体胚から合計15匹のESマウスを作成し、蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。図3に示すように、得られた15匹すべてにおいて、胎盤でGFPが発現し、産仔では発現していなかった(図3A-C)。これらの結果から、3x4倍体胚を使用してもESマウスに4倍体胚由来の細胞が大きく混入する可能性は低いと考えられる。次に、より詳細な解析を行うため、フローサイトメトリーによるGFP細胞の検出を行った。1xおよび3x4倍体胚より作成したESマウスをそれぞれ2匹ずつ使用し、脳および肝臓におけるGFP陽性細胞を検出した。解析の結果、1xおよび3x4
【0039】
倍体胚由来のESマウスとも、4倍体胚由来のGFP細胞の混入率は1%未満であった。
以上の結果から、3x4倍体胚を用いたESマウスは、従来法に由来するESマウスと同様に、ほぼ全ての構成細胞がES細胞由来であることが証明された。
(表3、ESマウスの表現型の解析)
【表3】
a平均±SD(g)。
bOE:開眼、AH:腹部ヘルニア、LO:巨大産仔、OELO:開眼および巨大産仔を併発した仔、OEAH:開眼および腹部ヘルニアを併発した仔。
えっ、4倍体でも1%未満とは言えリシピエント胚の混入があるんだ?
クローンか4倍体キメラかの区別はミトコンドリアDNAだけでないんだね。
【産業上の利用可能性】
【0040】
本発明は、トランスジェニック動物やノックアウト動物のごとき遺伝子改変非ヒト動物を効率的に作成する方法およびこの方法により作成された遺伝子改変非ヒト動物を提供する。そのため、病理学的な研究や新治療法の開発に用いる実験動物の製造、新薬の開発をはじめとする多くの産業分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【図1】図1は、倍化4倍体胚の細胞数の解析結果を示す。A-Eは1xから3x4倍体胚および正常胚(1x2n)をPI染色した写真、A’-D’は1xから3x4倍体胚および正常胚(1x2n)をCdx2で免疫染色した写真、A”-D”はそれぞれの写真を合成した写真である。A-A”は1x4倍体胚、B-B”は2x4倍体胚、C-C”は3x4倍体胚、D-D”は正常胚(1x2n)、E-E”は3x4倍体胚をPI(E)、Oct3/4 (E’)で染色した写真、およびその合成写真をE”として示した。スケールバー:A”-D”100μm。E”200μm。
【図2】図2は、129B6F1G1を用いた4倍体胚とのキメラ胚の作成を示す。A-Cは1x4倍体胚とES細胞(129B6F1G)のキメラ胚、D-Fは3xx4倍体胚とES細胞(129B6F1G)のキメラ胚を示す。A、Dは可視光写真、B、Eは蛍光写真、C、Fはそれぞれの合成写真である。スケールバー:200μm。
【図3】図3は、3x4倍体胚から作出されたESマウスの解析である。(A-C)GFPを発現する3x4倍体胚とE14 ES細胞を用いたESマウスである。(A)可視光写真を示す。(B)蛍光写真を示す。(C)AとBの合成写真を示す。胎盤においてのみ4倍体胚由来(GFP陽性)の細胞が確認される。(D、E)フローサイトメトリーによる解析結果である。1x4倍体胚由来のESマウス(D)および3x4倍体胚由来のESマウス(E)の脳(左パネル)および肝臓(右パネル)におけるGFP陽性細胞の存在頻度を解析した。1xおよび3x4倍体胚由来のESマウスともGFP陽性細胞の存在頻度は1%未満であった。
【出願人】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】独立行政法人理化学研究所
【出願日】
平成20年1月4日(2008.1.4)
【代理人】
【識別番号】100081422
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 光雄
【識別番号】100084146
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 宏
【識別番号】100116311
【弁理士】
【氏名又は名称】元山 忠行
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
【公開番号】
特開2009-159878(P2009-159878A)
【公開日】
平成21年7月23日(2009.7.23)
【出願番号】
特願2008-89(P2008-89)
以上よ。
顕微授精の件は写真も残されていると手記に書かれているからね。
本当なら裁判で証拠採用されたらもう若山さんはアウトだな。
根本さんが外堀を埋めたね。
マウス裏金疑惑には触れなかったね。
僕はあれでいいと思う。必要な理解は書き切られている。後はいかなる手法で
あったかということだな。
あなたイエスの教えに反して約束したわよね。次はTs.Markerさんの問題ね。
神があなたに残りの人生を与えている限りにおいて約束は守ってよ。
釣りの時間を制約しない限りにおいてね。
いいわよ。明日にしましょ。
youtube.com/watch?v=UXOYcd6KZ0E
自死の自由を!
安楽死施設をつくりましょう!
モーニン、小町ちゃん。
コーヒーでしょ。
約束よ。
>>
288 :名無しさん :2017/05/03(水) 17:37:33
3個または4個の4倍体胚にES細胞を移入してキメラ胚を作製する。
13 :名無しさん :2017/05/04(木) 09:46:19
特開2009-159878
701: 名無しさん :2017/05/13(土) 10:25:13
ESを持っていれば、マウスを維持し続けなくともF1マウスを好きなときに作出できる。
702: 名無しさん :2017/05/13(土) 20:38:12
そのESを指差して、これが怪しい..。と言うこともできる。
703: 名無しさん :2017/05/13(土) 23:29:24
20個仮親にいれれば5匹は産まれる。アベレージ20%。アーティクルの4nキメラのコントロール実験としてESクローンのデータが載ってる。5匹はちょうどいい数だ。すべて♂になってしまうが。遺伝子の誤差は1%未満。
気にするな、ただの妄想だ。
>>
704: 名無しさん :2017/05/13(土) 23:55:01
FLSは、1/E CTSは5月。しかし、4月には「僕にマウス」系でコントロールES作成。
コロニーはいつ本当に作られた?
テクニカルスタッフや小保方さん本人は途中から直接そのコロニーから仔マウスをという証言はあったが、マウスの管理記録はない。
「あの日」には、途中、光る精子でジャーㇺトランスミッション実験を端折ったとある。そして、その後、Acr付ヘテロと判明しているにもかかわらずCTSが作成された。
705: 名無しさん :2017/05/14(日) 00:05:08
①TSA処理によるリプログラミングの補助(寺下博論、LeeさんiPs)
②3または4個の胚をくっつける方法
キメラが出来そうな気配だ。
706: 名無しさん :2017/05/14(日) 00:21:56
GLで成功したならば、同様な環境を胚外で目指すな。
ESとのco-culture。GLSやAC129は、相手に駆逐されたのかも。
Tru-Seqのコンタミは「chipはいいが...」のサンプルだろう。
なんだい、いきなりかよ。
次はTs.Markerさんの課題について考えてみると言ったわよね。取り敢えず
ここでの書き込みに関してどう思うの?
まず特許の件は昨日までに一応お勉強したよな。あれは後の書き込みでTs.Markerさんの示唆と分かるね。
次に701と702は後と繋がってはいるがTs.Markerさんかどうかはっきりしない。独立的に読むと意味のない書き込みだね。
ただ、彼なら何か説明していないことがあるんだろうけど、説明がない以上はコメントのしようがない。
マウスは凍結受精卵でいくらでも保存されていてESなんて使うことはない。人間の体外受精卵も凍結後本人の
体調を安定させてから支給に戻すくらいだ。この二つのコメントはパスするよ。
支給は子宮ね。分かったわ。703からね。
>>
703: 名無しさん :2017/05/13(土) 23:29:24
20個仮親にいれれば5匹は産まれる。アベレージ20%。アーティクルの4nキメラのコントロール実験としてESクローンのデータが載ってる。5匹はちょうどいい数だ。すべて♂になってしまうが。遺伝子の誤差は1%未満。
気にするな、ただの妄想だ。
<20個仮親にいれれば5匹は産まれる。>というところが、昨日までにお勉強した
特許開示書類に書かれていることは分かってるんだから、この書き込み者があの
文書を紹介してくれた人だ。<気にするな、ただの妄想だ。>という書き込みで
これがTs.Marker氏だと分かる。可能性の検討を妄想と自虐的に書くところは
私よりずっと若い人でね、我々にはそういう思考習慣はない。
妄想だと言う言葉でレッテル貼りする幼い反論法がこういうコメント欄に多いんで
その反作用としてTSさんのような自虐的言辞が生まれてくるのね。私たちは
全ての可能性を読みつくそうとしないような知恵遅れは今までここでは叩き
出してきてるからね。可能性の検証を妄想だなんて思わないわよね。
それよりも私が以前書いた質問は<アーティクルの4nキメラのコントロール実験として
ESクローンのデータが載ってる。>というところよね。そんな言及はどこにもないから
まずそこがどこか答えて欲しいと既に書いてるわ。
君の質問はまだ全部出し尽くしてないという流れなので返事がないのかな。
でもクローンなんて論文には無いのは間違いないので、ここで、はたと、あれ、
TSさんじゃないのかなと。ふふふ。
あれ、そうなの?でも書き込みは続くわね。
>>
704: 名無しさん :2017/05/13(土) 23:55:01
FLSは、1/E CTSは5月。しかし、4月には「僕にマウス」系でコントロールES作成。
コロニーはいつ本当に作られた?
テクニカルスタッフや小保方さん本人は途中から直接そのコロニーから仔マウスをという証言はあったが、マウスの管理記録はない。
「あの日」には、途中、光る精子でジャーㇺトランスミッション実験を端折ったとある。そして、その後、Acr付ヘテロと判明しているにもかかわらずCTSが作成された。
どう考えてもTSさんよ。
そうだね。彼の思考を追っている人にはコロニーの有無を問題にしてのが
TSブログだと知っている。ただ、この人はTSさんの疑問を自分のものと同意して
書き込んでいる別人かもしれないね。でも、僕はこれがTSさんだと言う証拠を
持ってるけどね。
それよりもここで彼が重要なことを言ってるよね。
<その後、Acr付ヘテロと判明しているにもかかわらずCTSが作成された。>と。
なるほど。これがTSさんだと確定するとコントロールとしてのESクローンデータと
彼が推定しているものが何かと言うことが再び問題になるのね。
先に進むわよ。
>>
705: 名無しさん :2017/05/14(日) 00:05:08
①TSA処理によるリプログラミングの補助(寺下博論、LeeさんiPs)
②3または4個の胚をくっつける方法
キメラが出来そうな気配だ。
ここが彼がこの特許書類を貼り付けて注意喚起したかったことのようだね。
つまりクローンではなくSTAP細胞を使ってキメラが出来た可能性を示唆している。
この件は私たちが先回りして無いと結論付けたわね。ただ、状況と証言ホジュンからの判断で
物証は調べるしかないのよね。
証言ホジュン→証言矛盾 だね。
調べれば分かることはこの文書からも分かったね。ミトコンドリアDNAだけだと
はっきりしない可能性も残るんだけど4Nでもリシピエント胚の分化細胞が1%は
残ると分かった。
TSさんはクローンではないと言う説だからね。
ただ、①も②も普通にntESの達成率の向上手段だよ。キメラはできるよ。当然。
クローン化させてない普通のSTAP細胞を使って出来るかどうかと言う問題とは
別だ。それはsTAP細胞時代の多能性段階の事実が解明されないとどちらだったかは
分からない。でも証言矛盾からの推論でできてたらこんな問題になってないと
いうのが、我々の判断だ。
sTAP細胞時代→STAP細胞自体 ね。
>>
706: 名無しさん :2017/05/14(日) 00:21:56
GLで成功したならば、同様な環境を胚外で目指すな。
ESとのco-culture。GLSやAC129は、相手に駆逐されたのかも。
Tru-Seqのコンタミは「chipはいいが...」のサンプルだろう。
<「chipはいいが...」>の省略が彼の特徴で、昔からめんどくさがりやで
めんどくさいと自分で書いておられたこともあるくらいで、昔からフォローしている
人間にはすぐTSさんと分かる。これが僕が先に言った本人である証拠だ。
で、<GLで成功したならば、同様な環境を胚外で目指すな。>のところ、そもそもGLは
胚外で作るんだよ。キメラ胚ってインジェクションでも集合法でも培養してESを作る。
子宮に戻すのは胎児を作るときだ。<ESとのco-culture。>というのはDORAさんと
議論していたところだけど手法に誤解があるんじゃないかな。co-cultureというのは
別の概念だ。この辺り彼の考察も曖昧だと思うよ。<GLSやAC129は、相手に駆逐されたのかも。
Tru-Seqのコンタミは「chipはいいが...」のサンプルだろう。>の部分はその曖昧な推定の流れのままに
ボンヤリとイメージされているんじゃないかな。
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