STAP問題の全解に向けて - 1492994857

1：名無しさん：2017/04/24(月) 09:47:37: ここは広くていいぞ。
805：小野小町：2017/05/16(火) 13:10:06: まあ。ところで、幹細胞自体の作り方は小保方核クローンとは別問題なのね。
806：閲覧者：2017/05/16(火) 13:14:47: そうだね。小保方核クローンというのは若山さんが単純なESねつ造キメラなんかを
作って何の意味があるのかという問題から導かれた結論だ。というより、若山さんが
なぜ小保方さんを自分のラボに誘ったのかの動機から導かれたことだ。この動機は
小保方さんの細胞が最終論文通りにできようとできまいと無関係に彼は小保方さんの
細胞を欲しがったんだよ。
807：一言居士：2017/05/16(火) 13:28:40: そこはどうかな。彼は博論段階で既にキメラがスタンダードな意味ではできないことは知っていた。
にも関わらず彼女の腰掛を許したのはやはりこの細胞がなんであるのかと言うことに対する関心だったはすでしょ。
小保方さんは神戸に来てすぐにテラトーマ実験を始めている。これが若山さんの指示でなくて何であり得るかね。
彼はもう一度博論時の細胞を確認したかったんでしょ。テラトーマは出来なかったと思われるね。
ただ、細胞は所詮酸浴も物理刺激も結果的には同じ刺激惹起という発想だから小保方さんが理研で行ったのは
効率よくSTAP細胞を作るということだけだったはずだ。若山さんは既に最初の頃に物理刺激で作らせて
もう一度キメラ実験も確かめていて、更に、クローンも作ったと思うよ。
808：小野小町：2017/05/16(火) 13:30:46: なるほど。あなたがこだわっていた日程のタイトさはそう考えると
十分に時間があったことになるわね。
809：在原業平：2017/05/16(火) 13:33:53: 手記には何週間かが経った頃とあるが、そこで彼は待遇条件を示して彼女を
理研に入れようとしたが、その時に既に自分のクローン技術との融合が可能だと言う
感触を得ていたということかい。
810：一言居士：2017/05/16(火) 13:36:15: そうだ。キメラもできない。テラトーマも簡単でない。しかし、三胚様分化はする。
そしてクローンを作ってみて達成率が上がったような感じがするということで
西川さんに話を上げたということではないかな。無論待遇条件は若山さん単独では
示せないのは常識だね。
811：閲覧者：2017/05/16(火) 13:39:54: そのあたりがどうかなと思っているんだがね。というのもこの頃まだOct4-GFPを使っていない段階だ。
酸浴はいろいろと試してはいるんだろうが、若山さんに最初に作って見せたのは初期の物理刺激の細胞だ。
するとこれが三胚様分化する確率は1/20とか1/50だ。分化実験なら簡単だが、クローンの達成率向上が確認
できるような状況だっただろうかね。
812：シャーロック・ホームズ：2017/05/16(火) 13:44:07: 通常のクローン作製は普通の体細胞核を使う。これで2から3%の達成率だ。
それを物理刺激スフィア塊の中の当たり5%から2%でどれだけ向上するか。
僅かに向上が確認できるかな。テラトーマは5%から2%だとまず当たるだけの
問題でも大変な上に、PGAが必要なくらい弱い上に、加えて免疫不全マウスが
沢山必要だな。
813：小野小町：2017/05/16(火) 13:47:28: その問題は若山さんが自分の技術との融合をどの段階で考え始めたのかということでしょ。
最初からか、それともやはりGOF酸浴細胞でもやはりキメラができない細胞だと
確定してからかという。
814：ドクター・ワトソン：2017/05/16(火) 13:49:57: 日程のタイトさがそこに横たわっている問題だな。F1で出来なかったからでは
今からクローンをつくるというのにはとても時間が足りない感じだね。
既に裏で着々と別に準備が進められていたと。
815：閲覧者：2017/05/16(火) 13:54:49: 少なくともGOFの酸浴細胞で出来なかったときではないかな。このときなら
GOFのクローンは裏で同時進行できる。それから最初の失敗したF1でこれもクローンを
作れる。そしてナイフ切り分けで、先に作られていたF1ntESを使ってキメラと
幹細胞を作れる。幹細胞の作り方は正に今検討しているこの特許書類にあるね。
４倍体胚を3つ使ってESと集合胚を作る。
816：小野小町：2017/05/16(火) 13:58:02: 4Nキメラが11/28なのにどうしてGOFの幹細胞であるGLの樹立開始日が11/25なのか
と言う問題も整合してきそうね。ただ、あなたの4Nキメラとされているのは実は
クローン胎児だというのは同なのかしらね。微妙な日程関係になってくるわね。
817：ドクター・ワトソン：2017/05/16(火) 13:59:18: 幹細胞を作るのはESを作るより簡単で日程も短いと言ったのは若山さんだね。
それも参考になるね。
818：ヘーゲル：2017/05/16(火) 14:08:52: 特許書類にある作り方だと可能性としてはESの代わりにSTAP細胞を
使ってもキメラ胎児はできるよね。むろん、そういう多能性細胞であったとしての
話だが。
819：カール・ヤスパース：2017/05/16(火) 14:11:00: 師匠、その場合は成功しているということになって、若山さんはマウスが違ってたなんて言い出す
必要が無いのではありませんか。どういう事情にせよ、若山さんが嘘をついていることになるわけですから
彼が犯人ですね。
820：ヘーゲル：2017/05/16(火) 14:12:35: 彼が犯人であり実験は成功していたというケースはないのかね。和モガさんは
彼は犯人でなく、かつ実験は成功していたという仮説なんだろ。
821：小野小町：2017/05/16(火) 14:16:07: 実験が成功していたか否かと言う問題と若山さんが犯人であるか否かとは
独立した問題であり得るということね。ただ、今問題になっているのは小保方さんが
既存ESで若山さんに偽キメラを作らせたという濡れ衣だわよね。いったい、
小保方さんの濡れ衣に対して、真実は何通りでありうるの?
822：在原業平：2017/05/16(火) 14:39:38: １.既存ES細胞によるねつ造キメラ・ねつ造幹細胞である。(桂報告)
①犯人は小保方さん
②犯人は若山さん
③犯人は第三者
2.既存ES細胞によるねつ造キメラではない。(桂報告の否定)
①論文通りのキメラ成功(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
②特許書類にある集合キメラでの成功(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
③STAP細胞クローン胚からのntESキメラ成功(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
④もっと別の作成方法(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
3.既存ES細胞によるねつ造幹細胞ではない。(桂報告の否定)
①論文通りの培地誘導幹細胞である。(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
②クムリナ書き込みにあるキメラ胚を使ったESである。(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
③クローン胚からのntESのキメラ胚を使ったESである。(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
④そのほかのやり方である。(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
823：小野小町：2017/05/16(火) 14:42:49: まあ、小保方さんは既存ESをコンタミさせる以外には偽キメラを作る技術をもってないから
桂報告の仄めかしを否定したら犯人は例の論理から第三者でない以上は若山さんにしかならないのよね。
824：在原業平：2017/05/16(火) 14:51:10: 1の①でない。(初期実験)
1の②でない。(動機がない)
1の③なら2や3には行けない。2や3に行くのなら1の③はない。
また③そのものがない。
2と3は①しかない。
825：閲覧者：2017/05/16(火) 14:53:20: そうだなあ。1の②でない。(動機がない)というところはそうだが
2と3もねつ造動機は無いんだよね。あったらおかしい。そうでなくて
結果的にそのように進んでしまったということでしょ。
826：一言居士：2017/05/16(火) 14:55:32: 欲でしょ。ちょっとした嘘のつもりが周りを巻き込んでしまって身動きできなくなって
結果的にねつ造論文になってしまった。そのちょっとした嘘は他愛のないことだったはずなんだが
人ひとり自決すると言う悲惨な結果になってしまった。
827：小野小町：2017/05/16(火) 14:57:37: 山梨で一大プロジェクトという夢を見たのね。どうもそれが全ての原因かな。
828：一言居士：2017/05/16(火) 15:01:51: その底流には転勤と言う予想される環境の激変による精神の不安定化、そして同業の
山中氏のノーベル賞受賞に対するショック、更には東北震災という日本全体の精神の
不安定化も影響していたところに小保方さんの細胞が輝いて見えたと言うことがあるんでしょ。
笹井さんにもそれが当てはまるかもしれないね。
829：閲覧者：2017/05/16(火) 15:05:25: その他愛ない筈の嘘は裏にとても深い事情を秘めてたんでしょ。彼が考えているほど
単純な事情ではなかった。彼女の細胞はヴァカンティの悲願でもあったんだな。
共同研究協約書を開示してもらいたいね。
830：在原業平：2017/05/16(火) 15:07:59: 訂正
>>
824 ：在原業平：2017/05/16(火) 14:51:10
2と3は①しかない。
↓
2と3は②しかない。
831：シャーロック・ホームズ：2017/05/16(火) 15:33:52: 小保方さんの細胞は自然の不可思議の尻尾を掴んだものかもしれないね。
でも、あの実証では人を納得させることはできないから、これからもっと厳密な研究を
進めなければならないね。
キメラができたのは野依さんの言ったように若山さんの名人芸によるんだね。
彼も別にねつ造論文で世間を驚かそうなんて思ったはずもないんでね。そもそも
受賞歴もある人だよ。ただ、小保方さんの細胞をヴァカンティから奪い取ろうとしたというより
自分と研究した方が生産性が高いと勝手に思い込んで、ちょっとした嘘で彼女を
誘い込もうとしたが、それは彼が舞い上がっていて、冷静さを欠いていたんだね。
彼女の細胞はハーバードの発見に帰属している。それを安易に受け止めていたんだろうな。
832：小野小町：2017/05/16(火) 15:37:37: あなたのストーリーではやはり春頃の特許での米側との確執のころから
逃げ道をこしらえていたと?
論文受諾までは何とかリジェクトされないかと期待していたがとうとうアクセプトされてしまって
もはやこれまでとタイミングを見てあらかじめ用意していた「僕のマウス」ストーリーを語り始めたと。
833：ドクター・ワトソン：2017/05/16(火) 15:41:52: ８月の責任著者を降りたいと言った頃、笹井さんに何かしら仄めかそうとしたが
笹井さんは聞く耳持たなかったということかな。はっきりと言うわけにもいかないからな。
中途半端なことを言って、笹井さんは笹井さんで論文を通すことが自分の仕事であり、出世への
道だからね。若山さんがあれはクローンだよとでも言わない限りは、そんなことはラボの
ミーティングテーブルの上で検討すべきことだと言ったというのもむべなるかな、かな。
834：小野小町：2017/05/16(火) 15:55:09: あなた方は嘘をついているという意味での若山さん犯人説は動かないのね。
ただ、どんな手法であったか。どんな経緯であったかと。
835：一言居士：2017/05/16(火) 15:56:45: そうです。大逆転があるとしたらペンディングしているテラトーマ問題に関して
致命的なミッシングリングの暴露があったときでしょうかね。
836：小野小町：2017/05/16(火) 15:58:35: 和モガさん達のこだわっている論文通りにキメラが出来ていた可能性はないと。
837：一言居士：2017/05/16(火) 16:08:23: それは物証が確認されていないので何とも言えないことではあるんですが
まず、できてたらこんな問題にならないでしょうと言う自然な疑念への回答が要る。
もう一つは出来ていたのに隠しているというそのことが既に小保方さんへの犯罪になる。
犯罪と知ってあれはねつ造だと若山さんが騒いでいるというのですか。
論文通りにできてないと言って皆の反対を押し切って若山さんが取り消したんでしょ。
では第三者かと言うと、どうして二人の間に致命的な対立があるんですか。かたや、
光る精子で顕微授精してたと証言し、かたやなんでアクロシンマウスが使われているのか
分からないと言ってる。どっちかが嘘ではないですか。第三者はない。
838：小野小町：2017/05/16(火) 16:10:22: でも、キメラはできてる。なんでか。クローンしか考えられないと。
839：デラ・ストリート：2017/05/16(火) 16:14:56: 小保方さんが何らかの方法で太田ESを手に入れてコンタミしたか、さもなければ
小保方さんは何もしないが、若山さんがクローン技術を使ってキメラを作った
という二者択一なのね。その間のグラデーションはないと。結構つらい選択よね。
それが人々を砂漠のダチョウにしていると。
840：ペリー・メイスン：2017/05/16(火) 16:18:42: 若山さんがSTAP幹細胞のジャームライン確認でなくても「光る精子」を
顕微鏡下で見ていただけでアウトだね。なにしろ彼は「僕のマウス」を
渡したことになっていて、光る精子なんて知らないはずなんだからね。
彼の記者会見見たでしょ。問題は手記記述が事実であると言う証拠だ。
841：デラ・ストリート：2017/05/16(火) 16:21:45: あの時点では彼は「光る精子」を見ていてはいけないわね。だって「僕のマウス」を
渡したと言ってるんだから。それ以前には何度でも見ていたことは分かり切ってる。
842：一言居士：2017/05/16(火) 16:25:34: ４Nキメラがヘテロでしかもテラトーマにアクロシンがあったというのは渡したマウスが
岡部マウスであったかさもなければ小保方さんが太田ESを使ったかだね。
若山さんは一回目が「僕のマウス」ではなかったことを記者会見で言ってないね。
なぜ黙っていたか。
843：小野小町：2017/05/16(火) 16:30:34: 一回目は「僕のマウス」ではないが二回目は「僕のマウス」だと言うと、
一回目のマウスと二回目のマウスと間違えただけだと思われやすいよね。
それを防ぐためには一回目のことは黙っていた方がいい。現に大半の人たちが
一回目も「僕のマウス」だと思い込んでいたでしょ。和モガさんですらそうだ。
刷り込み効果なんだよね。桂報告を良く吟味して初めてヘテロだと証言していた
と言うことが分かる。まして、記者会見の時桂報告は出てない。
844：一言居士：2017/05/16(火) 16:35:09: 小町ちゃん。男言葉になってる。ははは。
このジャームライントランスミッション実験の時に若山さんはまだ逃げの準備をしてなくて
迂闊にも「光る精子」で顕微授精してるんだよと小保方さんに説明してたのを
日記につけられてたかな。
845：ペリー・メイスン：2017/05/16(火) 16:38:55: 日記はいくらでも嘘はかけるから証拠にはならないけど、若山さんが
最初の実験でヘテロマウスを使って二度目は「僕のマウス」だったという
説明で一度目のマウスに関して黙っていたというのは事実だ。それを
同捉えるかと言う問題だね。そういうのが一つ二つでないとこれも傍証として
効力を発し始めるね。例えば李ESは関係ないということも、盗まれたものでないと
言うことも彼は告発時に黙っていた。
846：デラ・ストリート：2017/05/16(火) 16:42:37: 小保方さんが犯人なら太田ESらしいものが小保方さんのフリーザーに残されていることに
不思議はないんだけど、小保方さんがコンタミ犯でないのに彼女のフリーザーに太田ESらしきものが
あったら、誰かが置いたと推測するのが自然だわね。
847：一言居士：2017/05/16(火) 16:43:59: その問題が木星さんグループの共通した問題意識です。救う会の発端はここです。
848：閲覧者：2017/05/16(火) 16:53:29: 和モガさんがその問題を一番最初に解決したんじゃなかったかな。あれは
太田ESでなくてFLSだと言うことでしょ。近親率がおかしいと初めて指摘した。
我々も木星リストで小保方さんがFLSだと言っていることを指摘している。
849：小野小町：2017/05/16(火) 16:57:10: 木星リストには
FLS→129ESと書いていた
とあって、
129GFP+-について
FLSのことだろうとあるわね。
小保方さんは自分が書いたとしていて、かつFLSだと思っているらしいわね。
850：一言居士：2017/05/16(火) 16:59:22: 少なくとも文字を見て自分のものでないとは疑義してないね。
桂報告はその中身を調べて太田ESだとした。
851：閲覧者：2017/05/16(火) 17:03:48: うん。それを和モガさんはFLSだと言った。
桂報告がそれを太田ESだと言ったのは渡したマウスを「僕のマウス」だと
若山さんが言って、かつそこから出ない筈のアクロシンが出たからだね。でも、
我々はそれは最初から岡部マウスとのF1を渡していたと解したんだね。
若山さんの嘘だと。FLSはそもそもアクロシンが出て当たり前なのだと。
ならば、和モガさんの言うようにそれはFLSでおかしくない。
852：在原業平：2017/05/16(火) 17:06:38: 一回目のF1マウスは「僕のマウス」ではなく、かつテラトーマからアクロシンが
出ている。
853：小野小町：2017/05/16(火) 17:08:56: 彼は途中から逃げる算段として「僕のマウス」論による言い逃れを準備したという
あなた方の説ね。でもすぐには逃げる必要はなかった。なにしろ論文がリジェクトされている
現象でこれが世間での騒ぎになることはないからよね。
854：一言居士：2017/05/16(火) 17:12:54: しかし、桂報告後、再現実験終了後に彼らは自ら小保方攻撃としての石川告発を
行った。なぜか。
855：在原業平：2017/05/16(火) 17:15:54: 野依理事長の言葉だろうね。限りなく小保方を仄めかしながら桂報告は
犯人不詳とした。しかし、野依さんは去り際に未熟な小保方といい、名人芸の若山さんが
キメラを作ったと言った。
856：小野小町：2017/05/16(火) 17:20:46: 彼はねつ造した研究者が悪いんで管理の問題ではないから辞任の必要を
感じないとしていたんで、悔しかったんでしょうね。知ってるぞと言いたかったのね。
でも警察入れようと思えば入れられたわけでしょ。でもそうしなかった。
痛い腹もあったんでしょうね。
857：タカハシワケ：2017/05/16(火) 17:22:07: 日本も欧米と同じように警察を入れるべきだ。はっきりさせないといいことないよ。
858：孤舟：2017/05/16(火) 17:24:48: そろそろ本題の続き頼むよ。
859：小野小町：2017/05/16(火) 17:25:59: 【００１２】
また、本発明に用いられる４倍体胚は、１種類のみの胚から作成されてもよい。１種類の胚は、例えば、前記のようにＩＶＦまたは交配により作成される２細胞期の胚を含んでよいが、それらだけに限らない。所望により胚の融合は前記の方法と同様に行ってもよい。
【００１３】
次いで、４倍体胚をディッシュなどの適当な容器に入れ、ＥＳ細胞を移入し、培養してキメラ胚を作成する。４倍体胚をホストとしてＥＳ動物を作成する際に、一般的には、１個または２個の４倍体胚が使用されている（非特許文献２および３）。本発明における４倍体胚の個数は、好ましくは３個または４個であり、最も好ましくは３個である。本発明において、３個の４倍体胚をホストとしてＥＳ動物を作成する場合には、１個または２個の４倍体胚を用いる場合に比較して、目的とするＥＳ動物の作成効率が２．５～８．５倍程度上昇する。一方、５個またはそれ以上の４倍体胚を用いる場合には、ＥＳ動物の作成効率は３個または４個の場合より低下する。また、本発明で用いられる４倍体胚の発生時期は、電気融合直後の１細胞期以上であってよく、好ましくは、２細胞期から柔実胚期までである。最も好ましくは、４倍体胚の発生時期が２細胞期または４細胞期である。本発明では、４倍体胚を適当な容器に入れる前に、アシッドタイロード溶液などの当業者間で一般的な溶液を用いて透明帯を除去してもよい。本発明において、ＥＳ細胞の移入工程でディッシュを用いる場合には、当該分野で一般的に用いられるものであってよく、例えば、プラスチックディッシュを用いてもよい。その場合において、好ましくは１ウェルごとに小さな窪みを作成し、ＥＳ細胞の移入の際に４倍体胚を支持できるようにすることにより作成効率を向上させることができる。従って、本発明は、このような４倍体胚を支持できる窪みを有する容器、ならびに該容器を必須構成成分として含むＥＳ動物作成用キットなども提供する。
860：閲覧者：2017/05/16(火) 17:28:42: 集合キメラの作り方だけど、４N胚を３個というのが特許発見で、これで達成率が１割から２割にまで
上がると主張しているわけだね。
861：小野小町：2017/05/16(火) 17:29:31: 【００１４】
本明細書で用いられる「ＥＳ細胞」は、胚盤胞期の受精卵の内部細胞魂（ＩＣＭ）に由来する、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞を意味する。これまで、ホストとして４倍体胚を用いる効率的なＥＳ動物の作成においては、樹立されたＦ１由来のＥＳ細胞が使用されている（非特許文献４）。しかし、本発明では、ＥＳ細胞はあらゆる種類のものであってよく、当業者間で一般的に用いられるものを適用することができる。例えば、Ｅ１４、Ｒ１またＡＢ－１などの１２９系統に由来する細胞株、あるいはＴＴ２などの市販されている細胞株を含むが、これだけに限らない。また、本発明で用いるＥＳ細胞は、近交系または交雑系に由来する上記のごとき一般的なＥＳ細胞株であってよく、好ましくは近交系に由来するものである。本明細書で用いられる「近交系」とは、２０世代またはそれ以上にわたり兄妹交配が行われてきた系統のことをいう。また、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１、ＢＤｍｔ２またはＤＦＣ３Ｈのごとき核移植胚由来のＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）を本発明の方法に用いることができる。これらのｎｔＥＳ細胞は発明者らの研究室にて樹立された。ここで、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１はＧＦＰを発現する１２９Ｂ６Ｆ１系統のセルトリ細胞であり、ＢＤｍｔ２はＢＤＦ１系統の繊維芽細胞を用いた核移植胚由来のｎｔＥＳ細胞であり、ならびにＤＦＣ３ＨはＣ３Ｈの脳細胞から樹立した近交系に由来するｎｔＥＳ細胞である。
862：閲覧者：2017/05/16(火) 17:34:49: <１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１はＧＦＰを発現する１２９Ｂ６Ｆ１系統のセルトリ細胞>とあるのは
精巣の細胞なんでアクロシンGFPなんだね。太田さんの論文何だから無論岡部マウスだよね。
863：小野小町：2017/05/16(火) 17:36:02: 【００１５】
さらに、本発明に用いられうるＥＳ細胞は、ＥＳ細胞に類似した性質（本発明でドナーのＥＳ細胞として用いることができる性質）を有する細胞であってもよく、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などを含むが、それだけに限らない。
864：閲覧者：2017/05/16(火) 17:43:06: ２００８年から２００９年にかけての特許申請だよね。
IPSは２００６年の成功で２０１２年のノーベル賞受賞だね。
無論小保方STAPでもいいわけだよな。
もっともこれはできなかったと見てるが。出来ていたと言う人たちは
論文通りではないがこれも考えるのかな。
865：小野小町：2017/05/16(火) 17:44:50: 【００１６】
また、本発明に用いられるＥＳ細胞において、特定の遺伝子が導入されているか、または特定の遺伝子がノックアウトされていてもよい。
【００１７】
ＥＳ細胞を適当な条件で培養してから、４倍体胚に移入することができる。ＥＳ細胞の培養は、当該技術分野において一般的な方法を用いて行われてよい。例えば、基本培地として、KNOCKOUT（登録商標）DMEM（Invitrogen, CA, USA）を用いてよい。また、添加物として２０％胎児ウシ血清（Sigma-Aldrich, MO, USA）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）（１０００ユニット／ｍｌ，Invitrogen）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（invitrogen）、１％Ｌ－グルタミン（Specialty Media, NJ, USA）、１％非必須アミノ酸（Specialty Media）、１％ヌクレオシド（Specialty Media）、または１％ β－メルカプトエタノール（Specialty Media）を添加して培養したものであってよい。
【００１８】
また、本発明では、ＥＳ細胞の培養は、ゼラチンでコートしたディッシュ（フィーダー細胞非存在）上で行われてもよい。
【００１９】
本発明では、４倍体胚に移入されるＥＳ細胞の数は、１個以上であってよい。また、４倍体胚に移入されるＥＳ細胞の数は、好ましくは８～１５個である。移入されるＥＳ細胞は細胞塊として移入されてよい。本発明における移入は、例えば、ＥＳ細胞を４倍体胚に接触させる、あるいは注入することによって行ってもよい。これらの操作は、顕微鏡またはマイクロマニピュレータを使って行われるのが一般的である。
866：閲覧者：2017/05/16(火) 17:47:52: 0019の<あるいは注入することによって行ってもよい。>というのはインジェクションで
３個の４倍体胚を使うというのとちょっと違ってないかな。どうせ説明してくれる専門家もいないんだろうけどね。
ど素人の悲しさだね。
867：小野小町：2017/05/16(火) 17:49:25: 【００２０】
本明細書で用いられる「キメラ胚」は、由来の異なる２個以上の胚由来の細胞の結合により得られた胚を意味する。本発明に用いられうるキメラ胚は、好ましくは３個または４個の４倍体胚にＥＳ細胞を移入して培養した胚である。キメラ胚の培養は、例えば、ＣＺＢ培地にて約２４時間行われてよい。これらの条件は当業者が適宜定めうる。
868：閲覧者：2017/05/16(火) 17:50:58: 好ましくないのがインジェクションということなのかな。特許独特の定義なのかな。
869：小野小町：2017/05/16(火) 17:51:34: 【００２１】
次に、３個または４個の４倍体胚にＥＳ細胞を移入し、適当な条件で培養することにより得られたキメラ胚を偽妊娠非ヒト動物に移植して、子供を産ませ、ＥＳ動物を得る。キメラ胚を、偽妊娠非ヒト動物の卵管内または子宮内に移植してもよい。偽妊娠非ヒト動物は、ＥＳ細胞が由来する動物と同種の動物であればよく、系統が異なっていてもまたは同一であってもよい。例えば、偽妊娠非ヒト動物は、偽妊娠２．５日目のＩＣＲマウスであってもよいが、これだけに限定しない。本発明で用いられるキメラ胚の移植は、当業者間で一般的に用いられる方法によって行われうる。次いで、当業者間で一般的な方法に従って仮親（キメラ胚を移植された偽妊娠非ヒト動物）を飼育し、出産させてＥＳ動物を得ることができる。
870：閲覧者：2017/05/16(火) 17:53:37: ここは誰でも分かるよ。
871：小野小町：2017/05/16(火) 17:54:21: 【００２２】
前記のごとく、３個または４個、とりわけ３個の４倍体胚をホストとしてＥＳ動物を作成すると、従来の方法と比較して作成効率を高めることができる。また、この本発明の方法では、あらゆるＥＳ細胞が使用でき、例えば近交系由来のＥＳ細胞でも使用可能という利点を有する。さらに本発明の方法により得られたＥＳ動物は、奇形頻度が従来のＥＳマウスと同程度であり、十分に実用に供することができる。
872：閲覧者：2017/05/16(火) 17:55:05: なるほど、そうですか、と。
873：小野小町：2017/05/16(火) 17:55:50: 【００２３】
次に、下記の実施例に用いた主な材料および方法を示すが、本発明を限定するものではない。
【００２４】
使用したマウスおよびＥＳ細胞
ＢＤＦ１およびＩＣＲマウスはＳＬＣ（浜松、日本）から購入し使用した。ＩＣＲバックグラウンドのＧＦＰトランスジェニックマウスはｐＣＡＧ－ＥＧＦＰをベクターとして以前発明者らの研究室で樹立したものを使用した。使用したＥＳ細胞は４種類で、一般的なＥＳ細胞としてＥ１４（Hooper M, Hardy K, Handyside A et al. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature 1987;326:292-295）、核移植胚由来のＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）として、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１、ＢＤｍｔ２およびＤＦＣ３Ｈを使用した。Ｅ１４は、１９８５年にＭａｒｔｉｎＨｏｏｐｅｒ博士（Edinburgh, Scotland）らにより樹立され、ＰｅｔｅｒＭｏｍｂａｅｒｔｓ博士（Rockefeller University）が培養・保存していたものを分与して頂いた。１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１は、ＧＦＰを発現する１２９Ｂ６Ｆ１系統のセルトリ細胞、ＢＤｍｔ２はＢＤＦ１系統の繊維芽細胞を用いた核移植胚由来のｎｔＥＳ細胞で、以前発明者らの研究室で樹立されたものを使用した。また近交系由来のｎｔＥＳ細胞として、Ｃ３Ｈの脳細胞から樹立したｎｔＥＳ細胞（ＤＦＣ３Ｈ）を１０株ランダムにＥＳマウスの作成に使用した。
【００２５】
ＥＳ細胞の培養条件
ＥＳ細胞の培養は一般的な条件に従って行った。基本培地としてKNOCKOUT（登録商標）DMEM（Invitrogen, CA, USA）を用い、下記の添加物を加えたものを培養液として使用した：２０％胎児ウシ血清（Sigma-Aldrich,MO,USA）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）（１０００ユニット／ｍｌ，Invitrogen）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（invitrogen）、１％Ｌ－グルタミン（Specialty Media, NJ, USA）、１％非必須アミノ酸（Specialty Media）、１％ヌクレオシド（Specialty Media）、１％ β－メルカプトエタノール（Specialty Media）。ＥＳ細胞はゼラチンコートを施したディッシュ上においてフィーダー細胞非存在下で培養した。
874：閲覧者：2017/05/16(火) 18:00:46: 動物実験申請書にあるマウス購入業者の黒塗りの下にはＳＬＣ（浜松、日本）も
ありそうだね。ここに裏金蓄積があつたりして。E14なんてESも保存しているのね。
譲ってもらったんだから今でも大事に保管してるでしょうね。太田ESだって保管して
いるはずなんだけどね。
875：一言居士：2017/05/16(火) 18:01:49: 野依さんも痛い腹はあったんでしょうねえ。
876：小野小町：2017/05/16(火) 18:03:44: ま、ま、そこは別問題として。

【００２６】
４倍体胚の作成とＥＳマウスの作成
本実験で使用した４倍体胚は２種類の胚から作成した。１つはＢＤＦ１の精子と卵子を顕微授精（ＩＶＦ）させた胚（ＢＤＦ２）であり、もう１つはＩＣＲＧＦＰ雄とＩＣＲ雌を交配させた胚を使用した。後者の胚（ＩＣＲＧＦＰ）ではＧＦＰを発現するため、４倍体胚に由来する細胞の存在を緑色蛍光により確認できる。ＩＶＦは一般的に用いられている方法を用いて行った。具体的には、ＢＤＦ１マウスの精巣上体尾部から精子を回収し、ＴＹＨ培地（Toyoda Y, Yokoyama M, Hoshi T. Studies on fertilization of mouse eggs in vitro: I. In vitro fertilization of eggs by fresh epididymal sperm. Jpn J Anim Reprod 1971;16:147151）にて培養した。卵子は過排卵処理を施した雌ＢＤＦ１から採取し、ＴＹＨ培地を用いて培養した。ここに精子を１ｘ１０５細胞／ｍｌになるように添加することによりＩＶＦを行った。ＩＶＦ後、授精した胚を回収し、２細胞期胚を得るため、ＣＺＢ培地（Chatot CL, Ziomek CA, Bavister BD et al. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 1989;86:679-688）において２４時間培養した。一方、ＩＣＲＧＦＰ胚を得るためには、過排卵処理を施したメスＩＣＲと、オスＩＣＲＧＦＰマウスを一晩交配させた。翌朝、交配を確認し、その２４時間後に卵管を採取し、２細胞期の胚を回収した。ＢＤＦ２およびＩＣＲＧＦＰの２細胞期の胚を、電気融合装置（Model LF101、ネッパジーン（株）、千葉）を用いて電気融合させ、４倍体胚を作成した。電気融合に成功した胚を選別し、ＣＺＢ培地にて一晩培養した。
877：閲覧者：2017/05/16(火) 18:06:45: 小保方さんが理研に来る前にこのラボではこんなことをしてたんだねエ。
小保方さんがきてからも彼が顕微授精してたのを見たんだね。嘘でなければ。
878：一言居士：2017/05/16(火) 18:10:16: 見てもないことを空想で書くって、まずそれを思いつくことが大変だろうね。
もっともこんなふうな論文を読んでいれば創作は可能かも知れないが。
879：小野小町：2017/05/16(火) 18:15:13: 【００２７】
２～４細胞期に発生した４倍体胚を選別し、アシッドタイロード溶液を用いて透明帯を除去した。次いで、プラスチックディッシュ上に作成した小さな窪みに、１個（１ｘ）から３個（３ｘ）の４倍体胚を入れた。さらにその上から８～１５個のＥＳ細胞の細胞塊を入れることにより、ＥＳ細胞と４倍体胚のキメラ胚を作成した。ＣＺＢ培地にて２４時間培養後、得られたキメラ胚を偽妊娠マウス（偽妊娠２．５日目）の子宮内に戻した。これらのマウスを妊娠１８日目で帝王切開し、産仔の有無を解析した。
880：閲覧者：2017/05/16(火) 18:16:15: 集合キメラができました、と。
881：小野小町：2017/05/16(火) 18:16:59: 【００２８】
胚盤胞期胚の細胞数の解析
胚盤胞期の細胞数を数えるため、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色およびＣｄｘ２の免疫染色を行った。ＰＩでは全ての細胞が染まるため、全細胞数の指標として使用し、抗Ｃｄｘ２抗体では栄養外胚葉（ＴＥ）細胞のみが染まるため、ＴＥ細胞の細胞数の指標として使用した。細胞内部魂（ＩＣＭ）の細胞数を、全細胞数（ＰＩ陽性細胞）からＴＥ細胞数（Ｃｄｘ２陽性細胞）を差し引いた細胞数として計算した。具体的には、１ｘから３ｘの４倍体胚を胚盤胞期まで発生させ、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し（室温で４５分間）、ＰＢＳで３回洗浄後、抗Ｃｄｘ２抗体（１：２００； BioGenex, CA, USA）を室温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、２次抗体（goat anti-mouse IgG conjugated with Alexa Fluor 488; Molecular Probes, Eugene, OR, USA）と室温で３０分間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、１μｇ／ｍｌのＰＩ溶液に移し、共焦点顕微鏡を用いてそれぞれの胚盤胞期胚を撮影した。細胞数のカウントには、焦点写真をMetaMorph software（Universal Imaging Co., Downingtown, PA, USA）を用いて立体構築し、ＰＩ陽性細胞数およびＴＥ陽性細胞数をカウントした。この解析には、正常胚（１ｘ２ｎ）および１ｘないし３ｘの４倍体胚に由来する胚盤胞期の胚をそれぞれ１０個ずつ使用してカウントした。
882：閲覧者：2017/05/16(火) 18:20:19: 細胞数のカウントしたことが無いなんて言ってた人居なかったかな。それに染色も
小保方さんに任せなくても自分たちでできるんだし、パラフィンブロックも作れるのね。
ははは、博士さん達なんだから当たり前だよね。当たり前でないのはやったことないなんて
言ってることのほうだよねえ。
883：一言居士：2017/05/16(火) 18:21:47: はっはっは。白々しいにもほどがある。
884：小野小町：2017/05/16(火) 18:23:46: 【００２９】
新生仔ＥＳマウスの解析
ＥＳマウスを妊娠１８日目で帝王切開し、体重、胎盤重量の測定、および奇形（腹部ヘルニア、開眼、巨大産仔）の有無を観察した。また、ホストとしてＩＣＲＧＦＰの４倍体胚を用いた実験では、ＥＳマウスにおいて４倍体胚由来の細胞の有無を調べるため、ＥＳマウスの肝臓および脳組織を用いてフローサイトメトリーを行った。具体的には、新生仔ＥＳマウスから肝臓および脳を摘出し、ハサミで細切後、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液で培養した（３７℃で１５分間）。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを等量添加後、遠心分離し（３００ｇで７分間）、上清を捨てた後、ＰＢＳで同様に２回洗浄した。細胞を１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭに懸濁し、フローサイトメトリーに使用した。フローサイトメトリーにはＦＡＣＳａｒｉａ（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）を用い、それぞれの組織における主要細胞群を側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）を指標として同定した。主要細胞群中のＧＦＰ陽性細胞数を測定することにより、４倍体胚由来の細胞を同定した。
885：閲覧者：2017/05/16(火) 18:47:54: これは基本的には太田さんの実験なんだけど若山さんがボスだからね。若山さんが
フローサイトメトリーのやり方を知らないと言うことは考えられない。しかし、
手記には小保方さんが若山さんにセルソーターの機械の使い方を教えてあげたというくだりがあるね。
若山さん小保方さんの程度を試していないかな。
886：一言居士：2017/05/16(火) 18:48:59: 95Pだね。あの下りは細胞の作り方を盗もうとしているとも見えるところだな。
887：小野小町：2017/05/16(火) 18:50:10: 【００３０】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例】
【００３１】
Ａ．倍化ＥＳマウスの出産率の比較
本実験の目的は、複数の４倍体胚を用いることによりＥＳマウスの作成効率の向上を図ることである。そのためにまず、正常胚を用いて、倍化胚（３ｘおよび５ｘ）を作成し、その発生能を解析した。その結果、３ｘ正常胚では正常な範囲内で産仔を得ることに成功したが（５０％；８／１６）、５ｘ正常胚からは産仔を得るにいたらなかった（０％；０／８）。以上の結果から、過剰な胚の数は発生能を障害することが示唆された。この結果を元に本実験では１ｘから３ｘの４倍体胚とＥＳ細胞のキメラ胚を作成し、ＥＳマウスの出産率を比較検討した。
888：閲覧者：2017/05/16(火) 18:51:07: なるほど。
889：閲覧者：2017/05/16(火) 18:51:43: 【００３２】
Ｂ．倍化４倍体胚の細胞数の解析
ＥＳマウスの作成の前に、まず、倍化した４倍体胚の細胞数が実際に増加しているのかを検討した。授精後９６時間の１ｘから３ｘの４倍体胚をそれぞれ１０個ずつＰＩとＣｄｘ２の２重染色を行った。以前の報告（Koizumi N, Fukuta K. Preimplantation development of tetraploid mouse embryo produced by cytochalasin B. Exp Anim. 1995;44(2):105-109）と一致して、１ｘ４倍体胚では正常胚（１ｘ２ｎ）と比較して総細胞数の減少が認められた（表１および図１Ａ－Ａ”、Ｄ－Ｄ”）。一方で、２ｘ４倍体胚および３ｘ４倍体胚では、総細胞数の増加が確認された（表１および図１Ｂ－Ｂ”、Ｃ－Ｃ”）。これらの２ｘ４倍体胚および３ｘ４倍体胚では、ＴＥ細胞数およびＩＣＭ細胞数もそれぞれ増加していることが示された（表１）。また、３ｘ４倍体胚を抗Ｏｃｔ３／４抗体で免疫染色したところ、正常にＩＣＭ細胞が染色された（図１Ｅ－Ｅ”）。以上の結果から、胚盤胞期の倍化４倍体胚では、予想通り細胞数が増加しており（表１）、ＩＣＭなどへの分化も正常に行われることが証明された（図１Ｅ－Ｅ”）。
（表１．倍化４倍体胚の細胞数の解析）
【表１】
890：小野小町：2017/05/16(火) 18:54:54: あら自分で貼り付けたの?
【００３３】
Ｃ．倍化４倍体胚を用いたＥＳマウスの作成効率の検討
先の実験で倍化４倍体胚の細胞数の増加が確認されたので、次にＥＳマウスの作成効率の検討を行った。使用したＥＳ細胞は、一般的なＥＳ細胞株であるＥ１４、ｎｔＥＳ細胞として１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１（ＧＦＰ陽性）およびＢＤｍｔ２、ならびに近交系由来のＥＳ細胞株としてＤＦＣ３Ｈ（合計１０株をランダムに使用）を用いた。図２に示したように、ＧＦＰを発現する１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１を用いてキメラ胚を作成したところ、３ｘ４倍体胚にＥＳ細胞が正常に取り込まれることが示された（図２Ｄ－Ｆ）。
【００３４】
次に、各ＥＳ細胞と１ｘないし３ｘの４倍体胚とのキメラ胚を作成し、胚移植後の発生能の検討を行った。１ｘおよび２ｘ４倍体胚をホスト胚として用いた場合では、３系統のＥＳ細胞（Ｅ１４、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１およびＢＤｍｔ２）は、ＥＳマウスの作成効率が約１－３％と非常に低頻度であった（表２）。一方、３ｘ４倍体胚を用いた場合では、その作成効率が約２．５－８．５倍に向上した（８．６％：表２）。また、従来作成が困難と考えられていた近交系由来のＥＳマウスでも、３ｘ４倍体胚を用いることにより約７％の成功率で作成可能であることが示された（表２）。
【００３５】
以上の結果から、２ｘ４倍体胚では正常胚と同程度の細胞数を有するが（表１）、ＥＳマウスの作成効率は、３ｘ４倍体胚を使用したものが最も効率がよく（表２）、従来法の１ｘもしくは２ｘ４倍体胚では不十分であることが示された。
（表２．倍化４倍体胚を用いたＥＳマウスの作成効率の検討）
【表２】
891：閲覧者：2017/05/16(火) 18:55:50: なるほど。
892：小野小町：2017/05/16(火) 18:56:55: *:E14;一般的に用いられているES細胞。129B6F1G1およびBDmt2;ntES細胞。DFC3H;近交系由来ntES細胞。
【００３６】
Ｄ．倍化４倍体胚より作成された新生仔ＥＳマウスの解析
ＥＳマウスは奇形仔の頻度が高いことが知られているので、次に３ｘ４倍体胚より作成されたＥＳマウスの表現型を観察した。３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスは、体重・胎盤重量とも１ｘまたは２ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスと同程度であった（表３）。また開眼・腹部ヘルニア・巨大産仔の出現率なども差は認められなかった（表３）。以上の結果から、３ｘ４倍体胚を用いた場合であってもＥＳマウスの奇形頻度は、少なくとも従来のＥＳマウスと同程度であることが示された。
893：閲覧者：2017/05/16(火) 18:58:58: 奇形が多いんだね。でも今までとたいして変わらない頻度なんだから達成率の高さが自慢だと。
894：小野小町：2017/05/16(火) 19:00:03: 【００３７】
ＥＳマウスの最大の特徴は、体を構成しているほぼ全ての細胞がＥＳ細胞由来であるという点である。表１に示したように、３ｘ４倍体胚では、総細胞数のみならず、体を構成しうるＩＣＭ細胞も増加している。最後に、３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスが実際にＥＳ細胞由来の細胞で構成されているかを検討した。
【００３８】
ホストである４倍体胚由来の細胞とＥＳ細胞を区別するため、ＥＳ細胞にはＥ１４、ホストにはＩＣＲＧＦＰ由来の４倍体胚を使用した。このことにより、４倍体胚由来の細胞がＧＦＰを発現するため、ＥＳマウスにて４倍体由来の細胞を容易に確認することが可能となる。この方法を用いて、３ｘ４倍体胚から合計１５匹のＥＳマウスを作成し、蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。図３に示すように、得られた１５匹すべてにおいて、胎盤でＧＦＰが発現し、産仔では発現していなかった（図３Ａ－Ｃ）。これらの結果から、３ｘ４倍体胚を使用してもＥＳマウスに４倍体胚由来の細胞が大きく混入する可能性は低いと考えられる。次に、より詳細な解析を行うため、フローサイトメトリーによるＧＦＰ細胞の検出を行った。１ｘおよび３ｘ４倍体胚より作成したＥＳマウスをそれぞれ２匹ずつ使用し、脳および肝臓におけるＧＦＰ陽性細胞を検出した。解析の結果、１ｘおよび３ｘ４
【００３９】
倍体胚由来のＥＳマウスとも、４倍体胚由来のＧＦＰ細胞の混入率は１％未満であった。
以上の結果から、３ｘ４倍体胚を用いたＥＳマウスは、従来法に由来するＥＳマウスと同様に、ほぼ全ての構成細胞がＥＳ細胞由来であることが証明された。
（表３、ＥＳマウスの表現型の解析）
【表３】

a平均±SD(g)。
bOE:開眼、AH:腹部ヘルニア、LO:巨大産仔、OELO:開眼および巨大産仔を併発した仔、OEAH:開眼および腹部ヘルニアを併発した仔。
895：閲覧者：2017/05/16(火) 19:01:52: えっ、４倍体でも１%未満とは言えリシピエント胚の混入があるんだ?
896：一言居士：2017/05/16(火) 19:05:21: クローンか４倍体キメラかの区別はミトコンドリアDNAだけでないんだね。
897：小野小町：2017/05/16(火) 19:06:33: 【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、トランスジェニック動物やノックアウト動物のごとき遺伝子改変非ヒト動物を効率的に作成する方法およびこの方法により作成された遺伝子改変非ヒト動物を提供する。そのため、病理学的な研究や新治療法の開発に用いる実験動物の製造、新薬の開発をはじめとする多くの産業分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、倍化４倍体胚の細胞数の解析結果を示す。Ａ－Ｅは１ｘから３ｘ４倍体胚および正常胚（１ｘ２ｎ）をＰＩ染色した写真、Ａ’－Ｄ’は１ｘから３ｘ４倍体胚および正常胚（１ｘ２ｎ）をＣｄｘ２で免疫染色した写真、Ａ”－Ｄ”はそれぞれの写真を合成した写真である。Ａ－Ａ”は１ｘ４倍体胚、Ｂ－Ｂ”は２ｘ４倍体胚、Ｃ－Ｃ”は３ｘ４倍体胚、Ｄ－Ｄ”は正常胚（１ｘ２ｎ）、Ｅ－Ｅ”は３ｘ４倍体胚をＰＩ（Ｅ）、Ｏｃｔ３／４（Ｅ’）で染色した写真、およびその合成写真をＥ”として示した。スケールバー：Ａ”－Ｄ”１００μｍ。Ｅ”２００μｍ。
【図２】図２は、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１を用いた４倍体胚とのキメラ胚の作成を示す。Ａ－Ｃは１ｘ４倍体胚とＥＳ細胞（１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ）のキメラ胚、Ｄ－Ｆは３ｘｘ４倍体胚とＥＳ細胞（１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ）のキメラ胚を示す。Ａ、Ｄは可視光写真、Ｂ、Ｅは蛍光写真、Ｃ、Ｆはそれぞれの合成写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図３】図３は、３ｘ４倍体胚から作出されたＥＳマウスの解析である。（Ａ－Ｃ）ＧＦＰを発現する３ｘ４倍体胚とＥ１４ＥＳ細胞を用いたＥＳマウスである。（Ａ）可視光写真を示す。（Ｂ）蛍光写真を示す。（Ｃ）ＡとＢの合成写真を示す。胎盤においてのみ４倍体胚由来（ＧＦＰ陽性）の細胞が確認される。（Ｄ、Ｅ）フローサイトメトリーによる解析結果である。１ｘ４倍体胚由来のＥＳマウス（Ｄ）および３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウス（Ｅ）の脳（左パネル）および肝臓（右パネル）におけるＧＦＰ陽性細胞の存在頻度を解析した。１ｘおよび３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスともＧＦＰ陽性細胞の存在頻度は１％未満であった。
898：小野小町：2017/05/16(火) 19:07:27: 【出願人】
【識別番号】５０３３５９８２１
【氏名又は名称】独立行政法人理化学研究所
【出願日】
平成２０年１月４日（２００８．１．４）
【代理人】
【識別番号】１０００８１４２２
【弁理士】
【氏名又は名称】田中光雄

【識別番号】１０００８４１４６
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎宏

【識別番号】１００１１６３１１
【弁理士】
【氏名又は名称】元山忠行

【識別番号】１００１２２３０１
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田憲史
【公開番号】
特開２００９－１５９８７８（Ｐ２００９－１５９８７８Ａ）
【公開日】
平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【出願番号】
特願２００８－８９（Ｐ２００８－８９）
899：小野小町：2017/05/16(火) 19:10:25: 以上よ。
900：ドクター・ワトソン：2017/05/16(火) 19:59:22: 顕微授精の件は写真も残されていると手記に書かれているからね。
本当なら裁判で証拠採用されたらもう若山さんはアウトだな。
901：閲覧者：2017/05/16(火) 20:22:40: 根本さんが外堀を埋めたね。
902：一言居士：2017/05/16(火) 20:23:43: マウス裏金疑惑には触れなかったね。
903：在原業平：2017/05/16(火) 20:26:08: 僕はあれでいいと思う。必要な理解は書き切られている。後はいかなる手法で
あったかということだな。
904：小野小町：2017/05/16(火) 20:33:02: あなたイエスの教えに反して約束したわよね。次はTs.Markerさんの問題ね。
神があなたに残りの人生を与えている限りにおいて約束は守ってよ。