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STAP問題の全解に向けて
ここは広くていいぞ。
モーニン。小町ちゃん。コーヒーね。
天才君、どうだった。僕が祝福して送り出してあげたから釣れたろう。
ああ、ウォルトン卿、おかげさまで大漁でしたよ。行きがけ神様に約束するなと
命令されたのをアブラハムみたいに考え考え運転してたら赤信号なのに交差点を
横切ろうとしている自分に気づきました。危ないところで止まって少しバックしました。
ホント、約束するなと言う命令の意味が分かったとともに、あなたのグドラックの祝福も
思い出しちまいましたよ。
そのあとすべてを現在に集中して2時間半餌を打ち続けたんですが、マブナばっかりで
あなたのグッドラックは交差点で効力を失ったと思ってたんですが、その後仲間が見に来たんで
話しながら釣ってたらスフィア塊みたいにヘラの集団が寄ってきたのか、入れ食いになりました。
今日はご機嫌だねえ。考え事しながら運転しちゃだめだぜ。意識はいつも現在に
置いといてね。そうでないと出番がなくて意識さんがスネちゃうぜ。
はいはい、また悪友電話が来ない内に始めましょ。
>>
【0011】
本発明では、例えば、4倍体胚を2種類の胚を融合して作成してもよい。一方の胚を、当該技術分野において一般的な手法である顕微授精(IVF)を用いて作成してもよい。例えば、BDF1マウスの精子および卵子から、IVFにより胚を得てもよい。ここで、「BDF1マウス」はC57BL/6の雌とDBA/2Nの雄の交配によって作出される当該技術分野で一般的な系統をいう。IVFは、例えば、卵子を過排卵処理を施した雌から採取し、TYH培地にて培養し、精子を約1×105細胞/mlのごとき一定濃度となるように添加して行うことができる。その後、授精した胚を培養して2細胞期の胚を得てもよい。この時の培養は、例えば、CZB培地にて24時間行ってもよい(Chatot CL, Ziomek CA, Bavister BD et al. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 1989;86:679-688)。もう一方の胚を、例えば、動物を交配させることにより得てもよい。例えば、ICRマウスの雄および雌を一晩交配させ、翌朝交配を確認し、その24時間後に卵管を採取して2細胞期の胚を回収することにより胚を得てもよい。「ICRマウス」とは、一般的に使用される系統のマウスで、仔を多く産み、子育てを得意とする性質を有する。好ましくは、ICRマウスの雄がGFP遺伝子を有する。例えば、pCAG-EGFPベクターを有するICRバックグランドのGFPトランスジェニックマウス(ICRGFP)を含むが、これだけに限らない。これにより、ES動物を作成した際に、ホスト4倍体胚に由来する細胞をGFPタンパク質の発現で確認できることが好ましい。
顕微授精(IVF)が出て来たね。木星さんリストの117番にある。顕微授精は
ICSI:intracytoplasmic sperm injectionで体外受精をIVF: In Vitro Fertilizationと
言ってて、実際には同義だな。
>>
129B6 ICSI P4 ES1 3/17/05 1本 全くわからない
2005年にラボに居た人って以下ね。
若山照彦 2002〜
若山清香 2002〜
岸上哲士 2002〜
坂出裕子 2004〜
大田浩 2003〜2010
水谷英二 2003〜2009
引地貴亮 2003〜2008
THUY HONG BUI 2005〜2008
Nguyen Van Thuan 2002〜2006
山縣さんは2007年からで2005年にはいないんだね。野老さんもいないね。
太田さん、坂出さん、若山夫妻あたりの忘れ物かな。小保方さんは
全く分からないと答えているけどこの頃何があったか自分でも理解できてない
状態での聞き取りだから迂闊なことの言えない状況なんだよね。
顕微授精だからだれだれさん達とか推測すら言えない。全くわからないと
答えるよりないね。
手記は以下だわ。
>>
STAP幹細胞からできたキメラマウスのジャームライントランスミッションの実験の際、
「光る精子」を自身で採取し実験を行っていたにもかかわらず、若山先生は「STAP幹細胞は
自分の研究室にはいなかったマウスからできた細胞だった」と6月の記者会見で発表し、
まるで私がマウスや細胞をすり替えたかのような推論を社会に植えつけた。
彼女は彼らが行っていた自分たちの他の実験を見間違えたのではないということを
<STAP幹細胞からできたキメラマウスのジャームライントランスミッションの実験の際、>と
明確に書いてるね。証拠があるかどうかは別として、彼女はそれを知ってると主張してるわけだよね。
僕は和モガさんにもこういうところの証言矛盾に注意して欲しいと思ってるんだけどな。
というのも、この「光る精子」というのは無論Acr-CAG-GFPの入ったマウスの実験ということ
なんだけど、仮にこの手記証言が嘘だったとする。そんな事実はなかったのに彼女がそう書いているとするんだ。
すると当然そんな嘘をつくのは彼女が犯人だと言うことになるでしょ。逆にそういう「光る精子」が
あったとする。そして若山さんが顕微授精をしていたとする。するとまず、これだけであの記者会見での
岡部マウスの存在に迂闊にしていたという証言自体がおかしいということになるでしょ。更に、この実験は
小保方さんの実験とは別のものだったとすると、小保方さんが、わざわざ<STAP幹細胞からできたキメラマウスの
ジャームライントランスミッションの実験の際、>と書いていることは若山さんを陥れるための嘘ということになる。
つまりこの場合は彼女が犯人だ、しかし、それが本当だったとする。するともはや言い逃れできないくらい
若山さんが犯人だと言うことになるでしょ。つまり、どちらかが犯人なんでしょ。第三者が二人を騙している
と言うことはないよね。
一言居士さんが一研究者ブログの第一声で発した問ね。二人の証言に関して
重大な事柄に関して矛盾が出たらどちらかが犯人で第三者は無い。そうでないと
考える人は反論せよと。
賛同者1名だったかな。反論者はいなかった、というより、無視されたかな。ははは。
金髪さん以外はね。
でも、あれは無視されたというより問いの意味が理解されなかっただけだよ。
そこまで考え抜いている人たちは居なかったのさ。
僕は今あらためて和モガさんにもう一度一言居士さんの問いを投げかけているんだけどね。
一言居士さんはどちらかが犯人だと確信した後に小保方さん犯人仮説を追い続けて
追い続け切れず、反転して若山さん犯人仮説では桂報告の間違いをたくさん知ることになった。
そして若山さんが犯人ならESコンタミなんてするはずがないと推測したのね。
凡そ若山さんがねつ造のために小保方さんを自分のラボに誘うことなんかないのだと。すると
そもそも最初の実験はねつ造ではないということになる。しかし、キメラは出来ている。
それならクローンでしょと。そういうことね。
そうなんだよ。論文は書かれていない。だから論文ねつ造なんて最初にありはしないさ。
でもクローン胚を使ってキメラを作った時、それは論文ねつ造ではないが、小保方さんが
確認したかったことに対しては嘘になっていたんだよ。無論ここもまだ明確な嘘出はなくて
ただ自分の特殊な技術で作ったとしていただけだが、春に論文を書いた時点で、少なくとも
小保方さんはクローン技術を使ったキメラだと認識していない。その間違いを正さなかったのは
若山さんの犯意なんだよ。ただ、この問題は若山研の中にとどまっていたことで、
後に小保方さんが山梨大についてくれば解消していたかも知れないのさ。
まあ、その後のことは後に整理するとして、あなたのクローン仮説というのは
まず小保方さんのSTAP細胞の核を抜いてドナー卵の核と交換するのね。これが
クローン胚なのね。ここからはクローン胎児とntESと二つの両方に進めることができる。
普通のクローンは達成率は2、3%と低いからどちらの方向にもたくさん作らないといけないのよね。
胎児としてできて来たものとntESとなったものと両方が出来て来る。これは通常のクローンと
同様だけど、ここに小保方核を使うという新規さがあるのね。まあ、誰でもやってみたくは
なるでしょうね。小保方核は普通のクローンと違って細胞質の働きだけで初期化されるのではなく、
そもそも酸浴刺激で核が初期化されていることになってるわね。
そのntESからキメラと幹細胞らしきESを作る手法はこの特許文書にヒントが
ちりばめられているというわけか。でも君たち、残念だね。
何が?
悪友から電話だ。
まあ、まるで韓国ドラマみたいね。でも、慣れてるわ。事故起こさないでね。
youtube.com/watch?v=8eKQtQzS-YQ
さてさて。
あら、早いわね。
当てがはずれた。こういうこともあるよ。
まあ。ところで、幹細胞自体の作り方は小保方核クローンとは別問題なのね。
そうだね。小保方核クローンというのは若山さんが単純なESねつ造キメラなんかを
作って何の意味があるのかという問題から導かれた結論だ。というより、若山さんが
なぜ小保方さんを自分のラボに誘ったのかの動機から導かれたことだ。この動機は
小保方さんの細胞が最終論文通りにできようとできまいと無関係に彼は小保方さんの
細胞を欲しがったんだよ。
そこはどうかな。彼は博論段階で既にキメラがスタンダードな意味ではできないことは知っていた。
にも関わらず彼女の腰掛を許したのはやはりこの細胞がなんであるのかと言うことに対する関心だったはすでしょ。
小保方さんは神戸に来てすぐにテラトーマ実験を始めている。これが若山さんの指示でなくて何であり得るかね。
彼はもう一度博論時の細胞を確認したかったんでしょ。テラトーマは出来なかったと思われるね。
ただ、細胞は所詮酸浴も物理刺激も結果的には同じ刺激惹起という発想だから小保方さんが理研で行ったのは
効率よくSTAP細胞を作るということだけだったはずだ。若山さんは既に最初の頃に物理刺激で作らせて
もう一度キメラ実験も確かめていて、更に、クローンも作ったと思うよ。
なるほど。あなたがこだわっていた日程のタイトさはそう考えると
十分に時間があったことになるわね。
手記には何週間かが経った頃とあるが、そこで彼は待遇条件を示して彼女を
理研に入れようとしたが、その時に既に自分のクローン技術との融合が可能だと言う
感触を得ていたということかい。
そうだ。キメラもできない。テラトーマも簡単でない。しかし、三胚様分化はする。
そしてクローンを作ってみて達成率が上がったような感じがするということで
西川さんに話を上げたということではないかな。無論待遇条件は若山さん単独では
示せないのは常識だね。
そのあたりがどうかなと思っているんだがね。というのもこの頃まだOct4-GFPを使っていない段階だ。
酸浴はいろいろと試してはいるんだろうが、若山さんに最初に作って見せたのは初期の物理刺激の細胞だ。
するとこれが三胚様分化する確率は1/20とか1/50だ。分化実験なら簡単だが、クローンの達成率向上が確認
できるような状況だっただろうかね。
通常のクローン作製は普通の体細胞核を使う。これで2から3%の達成率だ。
それを物理刺激スフィア塊の中の当たり5%から2%でどれだけ向上するか。
僅かに向上が確認できるかな。テラトーマは5%から2%だとまず当たるだけの
問題でも大変な上に、PGAが必要なくらい弱い上に、加えて免疫不全マウスが
沢山必要だな。
その問題は若山さんが自分の技術との融合をどの段階で考え始めたのかということでしょ。
最初からか、それともやはりGOF酸浴細胞でもやはりキメラができない細胞だと
確定してからかという。
日程のタイトさがそこに横たわっている問題だな。F1で出来なかったからでは
今からクローンをつくるというのにはとても時間が足りない感じだね。
既に裏で着々と別に準備が進められていたと。
少なくともGOFの酸浴細胞で出来なかったときではないかな。このときなら
GOFのクローンは裏で同時進行できる。それから最初の失敗したF1でこれもクローンを
作れる。そしてナイフ切り分けで、先に作られていたF1ntESを使ってキメラと
幹細胞を作れる。幹細胞の作り方は正に今検討しているこの特許書類にあるね。
4倍体胚を3つ使ってESと集合胚を作る。
4Nキメラが11/28なのにどうしてGOFの幹細胞であるGLの樹立開始日が11/25なのか
と言う問題も整合してきそうね。ただ、あなたの4Nキメラとされているのは実は
クローン胎児だというのは同なのかしらね。微妙な日程関係になってくるわね。
幹細胞を作るのはESを作るより簡単で日程も短いと言ったのは若山さんだね。
それも参考になるね。
特許書類にある作り方だと可能性としてはESの代わりにSTAP細胞を
使ってもキメラ胎児はできるよね。むろん、そういう多能性細胞であったとしての
話だが。
師匠、その場合は成功しているということになって、若山さんはマウスが違ってたなんて言い出す
必要が無いのではありませんか。どういう事情にせよ、若山さんが嘘をついていることになるわけですから
彼が犯人ですね。
彼が犯人であり実験は成功していたというケースはないのかね。和モガさんは
彼は犯人でなく、かつ実験は成功していたという仮説なんだろ。
実験が成功していたか否かと言う問題と若山さんが犯人であるか否かとは
独立した問題であり得るということね。ただ、今問題になっているのは小保方さんが
既存ESで若山さんに偽キメラを作らせたという濡れ衣だわよね。いったい、
小保方さんの濡れ衣に対して、真実は何通りでありうるの?
1.既存ES細胞によるねつ造キメラ・ねつ造幹細胞である。(桂報告)
①犯人は小保方さん
②犯人は若山さん
③犯人は第三者
2.既存ES細胞によるねつ造キメラではない。(桂報告の否定)
①論文通りのキメラ成功(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
②特許書類にある集合キメラでの成功(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
③STAP細胞クローン胚からのntESキメラ成功(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
④もっと別の作成方法(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
3.既存ES細胞によるねつ造幹細胞ではない。(桂報告の否定)
①論文通りの培地誘導幹細胞である。(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
②クムリナ書き込みにあるキメラ胚を使ったESである。(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
③クローン胚からのntESのキメラ胚を使ったESである。(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
④そのほかのやり方である。(若山さんが嘘つきと言う意味の犯人)
まあ、小保方さんは既存ESをコンタミさせる以外には偽キメラを作る技術をもってないから
桂報告の仄めかしを否定したら犯人は例の論理から第三者でない以上は若山さんにしかならないのよね。
1の①でない。(初期実験)
1の②でない。(動機がない)
1の③なら2や3には行けない。2や3に行くのなら1の③はない。
また③そのものがない。
2と3は①しかない。
そうだなあ。1の②でない。(動機がない)というところはそうだが
2と3もねつ造動機は無いんだよね。あったらおかしい。そうでなくて
結果的にそのように進んでしまったということでしょ。
欲でしょ。ちょっとした嘘のつもりが周りを巻き込んでしまって身動きできなくなって
結果的にねつ造論文になってしまった。そのちょっとした嘘は他愛のないことだったはずなんだが
人ひとり自決すると言う悲惨な結果になってしまった。
山梨で一大プロジェクトという夢を見たのね。どうもそれが全ての原因かな。
その底流には転勤と言う予想される環境の激変による精神の不安定化、そして同業の
山中氏のノーベル賞受賞に対するショック、更には東北震災という日本全体の精神の
不安定化も影響していたところに小保方さんの細胞が輝いて見えたと言うことがあるんでしょ。
笹井さんにもそれが当てはまるかもしれないね。
その他愛ない筈の嘘は裏にとても深い事情を秘めてたんでしょ。彼が考えているほど
単純な事情ではなかった。彼女の細胞はヴァカンティの悲願でもあったんだな。
共同研究協約書を開示してもらいたいね。
訂正
>>
824 :在原業平 :2017/05/16(火) 14:51:10
2と3は①しかない。
↓
2と3は②しかない。
小保方さんの細胞は自然の不可思議の尻尾を掴んだものかもしれないね。
でも、あの実証では人を納得させることはできないから、これからもっと厳密な研究を
進めなければならないね。
キメラができたのは野依さんの言ったように若山さんの名人芸によるんだね。
彼も別にねつ造論文で世間を驚かそうなんて思ったはずもないんでね。そもそも
受賞歴もある人だよ。ただ、小保方さんの細胞をヴァカンティから奪い取ろうとしたというより
自分と研究した方が生産性が高いと勝手に思い込んで、ちょっとした嘘で彼女を
誘い込もうとしたが、それは彼が舞い上がっていて、冷静さを欠いていたんだね。
彼女の細胞はハーバードの発見に帰属している。それを安易に受け止めていたんだろうな。
あなたのストーリーではやはり春頃の特許での米側との確執のころから
逃げ道をこしらえていたと?
論文受諾までは何とかリジェクトされないかと期待していたがとうとうアクセプトされてしまって
もはやこれまでとタイミングを見てあらかじめ用意していた「僕のマウス」ストーリーを語り始めたと。
8月の責任著者を降りたいと言った頃、笹井さんに何かしら仄めかそうとしたが
笹井さんは聞く耳持たなかったということかな。はっきりと言うわけにもいかないからな。
中途半端なことを言って、笹井さんは笹井さんで論文を通すことが自分の仕事であり、出世への
道だからね。若山さんがあれはクローンだよとでも言わない限りは、そんなことはラボの
ミーティングテーブルの上で検討すべきことだと言ったというのもむべなるかな、かな。
あなた方は嘘をついているという意味での若山さん犯人説は動かないのね。
ただ、どんな手法であったか。どんな経緯であったかと。
そうです。大逆転があるとしたらペンディングしているテラトーマ問題に関して
致命的なミッシングリングの暴露があったときでしょうかね。
和モガさん達のこだわっている論文通りにキメラが出来ていた可能性はないと。
それは物証が確認されていないので何とも言えないことではあるんですが
まず、できてたらこんな問題にならないでしょうと言う自然な疑念への回答が要る。
もう一つは出来ていたのに隠しているというそのことが既に小保方さんへの犯罪になる。
犯罪と知ってあれはねつ造だと若山さんが騒いでいるというのですか。
論文通りにできてないと言って皆の反対を押し切って若山さんが取り消したんでしょ。
では第三者かと言うと、どうして二人の間に致命的な対立があるんですか。かたや、
光る精子で顕微授精してたと証言し、かたやなんでアクロシンマウスが使われているのか
分からないと言ってる。どっちかが嘘ではないですか。第三者はない。
でも、キメラはできてる。なんでか。クローンしか考えられないと。
小保方さんが何らかの方法で太田ESを手に入れてコンタミしたか、さもなければ
小保方さんは何もしないが、若山さんがクローン技術を使ってキメラを作った
という二者択一なのね。その間のグラデーションはないと。結構つらい選択よね。
それが人々を砂漠のダチョウにしていると。
若山さんがSTAP幹細胞のジャームライン確認でなくても「光る精子」を
顕微鏡下で見ていただけでアウトだね。なにしろ彼は「僕のマウス」を
渡したことになっていて、光る精子なんて知らないはずなんだからね。
彼の記者会見見たでしょ。問題は手記記述が事実であると言う証拠だ。
あの時点では彼は「光る精子」を見ていてはいけないわね。だって「僕のマウス」を
渡したと言ってるんだから。それ以前には何度でも見ていたことは分かり切ってる。
4Nキメラがヘテロでしかもテラトーマにアクロシンがあったというのは渡したマウスが
岡部マウスであったかさもなければ小保方さんが太田ESを使ったかだね。
若山さんは一回目が「僕のマウス」ではなかったことを記者会見で言ってないね。
なぜ黙っていたか。
一回目は「僕のマウス」ではないが二回目は「僕のマウス」だと言うと、
一回目のマウスと二回目のマウスと間違えただけだと思われやすいよね。
それを防ぐためには一回目のことは黙っていた方がいい。現に大半の人たちが
一回目も「僕のマウス」だと思い込んでいたでしょ。和モガさんですらそうだ。
刷り込み効果なんだよね。桂報告を良く吟味して初めてヘテロだと証言していた
と言うことが分かる。まして、記者会見の時桂報告は出てない。
小町ちゃん。男言葉になってる。ははは。
このジャームライントランスミッション実験の時に若山さんはまだ逃げの準備をしてなくて
迂闊にも「光る精子」で顕微授精してるんだよと小保方さんに説明してたのを
日記につけられてたかな。
日記はいくらでも嘘はかけるから証拠にはならないけど、若山さんが
最初の実験でヘテロマウスを使って二度目は「僕のマウス」だったという
説明で一度目のマウスに関して黙っていたというのは事実だ。それを
同捉えるかと言う問題だね。そういうのが一つ二つでないとこれも傍証として
効力を発し始めるね。例えば李ESは関係ないということも、盗まれたものでないと
言うことも彼は告発時に黙っていた。
小保方さんが犯人なら太田ESらしいものが小保方さんのフリーザーに残されていることに
不思議はないんだけど、小保方さんがコンタミ犯でないのに彼女のフリーザーに太田ESらしきものが
あったら、誰かが置いたと推測するのが自然だわね。
その問題が木星さんグループの共通した問題意識です。救う会の発端はここです。
和モガさんがその問題を一番最初に解決したんじゃなかったかな。あれは
太田ESでなくてFLSだと言うことでしょ。近親率がおかしいと初めて指摘した。
我々も木星リストで小保方さんがFLSだと言っていることを指摘している。
木星リストには
FLS→129ESと書いていた
とあって、
129GFP+-について
FLSのことだろうとあるわね。
小保方さんは自分が書いたとしていて、かつFLSだと思っているらしいわね。
少なくとも文字を見て自分のものでないとは疑義してないね。
桂報告はその中身を調べて太田ESだとした。
うん。それを和モガさんはFLSだと言った。
桂報告がそれを太田ESだと言ったのは渡したマウスを「僕のマウス」だと
若山さんが言って、かつそこから出ない筈のアクロシンが出たからだね。でも、
我々はそれは最初から岡部マウスとのF1を渡していたと解したんだね。
若山さんの嘘だと。FLSはそもそもアクロシンが出て当たり前なのだと。
ならば、和モガさんの言うようにそれはFLSでおかしくない。
一回目のF1マウスは「僕のマウス」ではなく、かつテラトーマからアクロシンが
出ている。
彼は途中から逃げる算段として「僕のマウス」論による言い逃れを準備したという
あなた方の説ね。でもすぐには逃げる必要はなかった。なにしろ論文がリジェクトされている
現象でこれが世間での騒ぎになることはないからよね。
しかし、桂報告後、再現実験終了後に彼らは自ら小保方攻撃としての石川告発を
行った。なぜか。
野依理事長の言葉だろうね。限りなく小保方を仄めかしながら桂報告は
犯人不詳とした。しかし、野依さんは去り際に未熟な小保方といい、名人芸の若山さんが
キメラを作ったと言った。
彼はねつ造した研究者が悪いんで管理の問題ではないから辞任の必要を
感じないとしていたんで、悔しかったんでしょうね。知ってるぞと言いたかったのね。
でも警察入れようと思えば入れられたわけでしょ。でもそうしなかった。
痛い腹もあったんでしょうね。
日本も欧米と同じように警察を入れるべきだ。はっきりさせないといいことないよ。
そろそろ本題の続き頼むよ。
【0012】
また、本発明に用いられる4倍体胚は、1種類のみの胚から作成されてもよい。1種類の胚は、例えば、前記のようにIVFまたは交配により作成される2細胞期の胚を含んでよいが、それらだけに限らない。所望により胚の融合は前記の方法と同様に行ってもよい。
【0013】
次いで、4倍体胚をディッシュなどの適当な容器に入れ、ES細胞を移入し、培養してキメラ胚を作成する。4倍体胚をホストとしてES動物を作成する際に、一般的には、1個または2個の4倍体胚が使用されている(非特許文献2および3)。本発明における4倍体胚の個数は、好ましくは3個または4個であり、最も好ましくは3個である。本発明において、3個の4倍体胚をホストとしてES動物を作成する場合には、1個または2個の4倍体胚を用いる場合に比較して、目的とするES動物の作成効率が2.5〜8.5倍程度上昇する。一方、5個またはそれ以上の4倍体胚を用いる場合には、ES動物の作成効率は3個または4個の場合より低下する。また、本発明で用いられる4倍体胚の発生時期は、電気融合直後の1細胞期以上であってよく、好ましくは、2細胞期から柔実胚期までである。最も好ましくは、4倍体胚の発生時期が2細胞期または4細胞期である。本発明では、4倍体胚を適当な容器に入れる前に、アシッドタイロード溶液などの当業者間で一般的な溶液を用いて透明帯を除去してもよい。本発明において、ES細胞の移入工程でディッシュを用いる場合には、当該分野で一般的に用いられるものであってよく、例えば、プラスチックディッシュを用いてもよい。その場合において、好ましくは1ウェルごとに小さな窪みを作成し、ES細胞の移入の際に4倍体胚を支持できるようにすることにより作成効率を向上させることができる。従って、本発明は、このような4倍体胚を支持できる窪みを有する容器、ならびに該容器を必須構成成分として含むES動物作成用キットなども提供する。
集合キメラの作り方だけど、4N胚を3個というのが特許発見で、これで達成率が1割から2割にまで
上がると主張しているわけだね。
【0014】
本明細書で用いられる「ES細胞」は、胚盤胞期の受精卵の内部細胞魂(ICM)に由来する、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞を意味する。これまで、ホストとして4倍体胚を用いる効率的なES動物の作成においては、樹立されたF1由来のES細胞が使用されている(非特許文献4)。しかし、本発明では、ES細胞はあらゆる種類のものであってよく、当業者間で一般的に用いられるものを適用することができる。例えば、E14、R1またAB-1などの129系統に由来する細胞株、あるいはTT2などの市販されている細胞株を含むが、これだけに限らない。また、本発明で用いるES細胞は、近交系または交雑系に由来する上記のごとき一般的なES細胞株であってよく、好ましくは近交系に由来するものである。本明細書で用いられる「近交系」とは、20世代またはそれ以上にわたり兄妹交配が行われてきた系統のことをいう。また、129B6F1G1、BDmt2またはDFC3Hのごとき核移植胚由来のES細胞(ntES細胞)を本発明の方法に用いることができる。これらのntES細胞は発明者らの研究室にて樹立された。ここで、129B6F1G1はGFPを発現する129B6F1系統のセルトリ細胞であり、BDmt2はBDF1系統の繊維芽細胞を用いた核移植胚由来のntES細胞であり、ならびにDFC3HはC3Hの脳細胞から樹立した近交系に由来するntES細胞である。
<129B6F1G1はGFPを発現する129B6F1系統のセルトリ細胞>とあるのは
精巣の細胞なんでアクロシンGFPなんだね。太田さんの論文何だから無論岡部マウスだよね。
【0015】
さらに、本発明に用いられうるES細胞は、ES細胞に類似した性質(本発明でドナーのES細胞として用いることができる性質)を有する細胞であってもよく、例えば、人工多能性幹(iPS)細胞などを含むが、それだけに限らない。
2008年から2009年にかけての特許申請だよね。
IPSは2006年の成功で2012年のノーベル賞受賞だね。
無論小保方STAPでもいいわけだよな。
もっともこれはできなかったと見てるが。出来ていたと言う人たちは
論文通りではないがこれも考えるのかな。
【0016】
また、本発明に用いられるES細胞において、特定の遺伝子が導入されているか、または特定の遺伝子がノックアウトされていてもよい。
【0017】
ES細胞を適当な条件で培養してから、4倍体胚に移入することができる。ES細胞の培養は、当該技術分野において一般的な方法を用いて行われてよい。例えば、基本培地として、KNOCKOUT(登録商標)DMEM(Invitrogen, CA, USA)を用いてよい。また、添加物として20%胎児ウシ血清(Sigma-Aldrich, MO, USA)、白血病抑制因子(LIF)(1000ユニット/ml,Invitrogen)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(invitrogen)、1%L-グルタミン(Specialty Media, NJ, USA)、1% 非必須アミノ酸(Specialty Media)、1% ヌクレオシド(Specialty Media)、または1% β-メルカプトエタノール(Specialty Media)を添加して培養したものであってよい。
【0018】
また、本発明では、ES細胞の培養は、ゼラチンでコートしたディッシュ(フィーダー細胞非存在)上で行われてもよい。
【0019】
本発明では、4倍体胚に移入されるES細胞の数は、1個以上であってよい。また、4倍体胚に移入されるES細胞の数は、好ましくは8〜15個である。移入されるES細胞は細胞塊として移入されてよい。本発明における移入は、例えば、ES細胞を4倍体胚に接触させる、あるいは注入することによって行ってもよい。これらの操作は、顕微鏡またはマイクロマニピュレータを使って行われるのが一般的である。
0019の<あるいは注入することによって行ってもよい。>というのはインジェクションで
3個の4倍体胚を使うというのとちょっと違ってないかな。どうせ説明してくれる専門家もいないんだろうけどね。
ど素人の悲しさだね。
【0020】
本明細書で用いられる「キメラ胚」は、由来の異なる2個以上の胚由来の細胞の結合により得られた胚を意味する。本発明に用いられうるキメラ胚は、好ましくは3個または4個の4倍体胚にES細胞を移入して培養した胚である。キメラ胚の培養は、例えば、CZB培地にて約24時間行われてよい。これらの条件は当業者が適宜定めうる。
好ましくないのがインジェクションということなのかな。特許独特の定義なのかな。
【0021】
次に、3個または4個の4倍体胚にES細胞を移入し、適当な条件で培養することにより得られたキメラ胚を偽妊娠非ヒト動物に移植して、子供を産ませ、ES動物を得る。キメラ胚を、偽妊娠非ヒト動物の卵管内または子宮内に移植してもよい。偽妊娠非ヒト動物は、ES細胞が由来する動物と同種の動物であればよく、系統が異なっていてもまたは同一であってもよい。例えば、偽妊娠非ヒト動物は、偽妊娠2.5日目のICRマウスであってもよいが、これだけに限定しない。本発明で用いられるキメラ胚の移植は、当業者間で一般的に用いられる方法によって行われうる。次いで、当業者間で一般的な方法に従って仮親(キメラ胚を移植された偽妊娠非ヒト動物)を飼育し、出産させてES動物を得ることができる。
ここは誰でも分かるよ。
【0022】
前記のごとく、3個または4個、とりわけ3個の4倍体胚をホストとしてES動物を作成すると、従来の方法と比較して作成効率を高めることができる。また、この本発明の方法では、あらゆるES細胞が使用でき、例えば近交系由来のES細胞でも使用可能という利点を有する。さらに本発明の方法により得られたES動物は、奇形頻度が従来のESマウスと同程度であり、十分に実用に供することができる。
なるほど、そうですか、と。
【0023】
次に、下記の実施例に用いた主な材料および方法を示すが、本発明を限定するものではない。
【0024】
使用したマウスおよびES細胞
BDF1およびICRマウスはSLC(浜松、日本)から購入し使用した。ICRバックグラウンドのGFPトランスジェニックマウスはpCAG-EGFPをベクターとして以前発明者らの研究室で樹立したものを使用した。使用したES細胞は4種類で、一般的なES細胞としてE14(Hooper M, Hardy K, Handyside A et al. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature 1987;326:292-295)、核移植胚由来のES細胞(ntES細胞)として、129B6F1G1、BDmt2およびDFC3Hを使用した。E14は、1985年にMartin Hooper博士(Edinburgh, Scotland)らにより樹立され、Peter Mombaerts博士(Rockefeller University)が培養・保存していたものを分与して頂いた。129B6F1G1は、GFPを発現する129B6F1系統のセルトリ細胞、BDmt2はBDF1系統の繊維芽細胞を用いた核移植胚由来のntES細胞で、以前発明者らの研究室で樹立されたものを使用した。また近交系由来のntES細胞として、C3Hの脳細胞から樹立したntES細胞(DFC3H)を10株ランダムにESマウスの作成に使用した。
【0025】
ES細胞の培養条件
ES細胞の培養は一般的な条件に従って行った。基本培地としてKNOCKOUT(登録商標)DMEM(Invitrogen, CA, USA)を用い、下記の添加物を加えたものを培養液として使用した:20%胎児ウシ血清(Sigma-Aldrich,MO,USA)、白血病抑制因子(LIF)(1000ユニット/ml,Invitrogen)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(invitrogen)、1% L-グルタミン(Specialty Media, NJ, USA)、1% 非必須アミノ酸(Specialty Media)、1% ヌクレオシド(Specialty Media)、1% β-メルカプトエタノール(Specialty Media)。ES細胞はゼラチンコートを施したディッシュ上においてフィーダー細胞非存在下で培養した。
動物実験申請書にあるマウス購入業者の黒塗りの下にはSLC(浜松、日本)も
ありそうだね。ここに裏金蓄積があつたりして。E14なんてESも保存しているのね。
譲ってもらったんだから今でも大事に保管してるでしょうね。太田ESだって保管して
いるはずなんだけどね。
野依さんも痛い腹はあったんでしょうねえ。
ま、ま、そこは別問題として。
【0026】
4倍体胚の作成とESマウスの作成
本実験で使用した4倍体胚は2種類の胚から作成した。1つはBDF1の精子と卵子を顕微授精(IVF)させた胚(BDF2)であり、もう1つはICRGFP雄とICR雌を交配させた胚を使用した。後者の胚(ICRGFP)ではGFPを発現するため、4倍体胚に由来する細胞の存在を緑色蛍光により確認できる。IVFは一般的に用いられている方法を用いて行った。具体的には、BDF1マウスの精巣上体尾部から精子を回収し、TYH培地(Toyoda Y, Yokoyama M, Hoshi T. Studies on fertilization of mouse eggs in vitro: I. In vitro fertilization of eggs by fresh epididymal sperm. Jpn J Anim Reprod 1971;16:147151)にて培養した。卵子は過排卵処理を施した雌BDF1から採取し、TYH培地を用いて培養した。ここに精子を1x105細胞/mlになるように添加することによりIVFを行った。IVF後、授精した胚を回収し、2細胞期胚を得るため、CZB培地(Chatot CL, Ziomek CA, Bavister BD et al. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 1989;86:679-688)において24時間培養した。一方、ICRGFP胚を得るためには、過排卵処理を施したメスICRと、オスICRGFPマウスを一晩交配させた。翌朝、交配を確認し、その24時間後に卵管を採取し、2細胞期の胚を回収した。BDF2およびICRGFPの2細胞期の胚を、電気融合装置(Model LF101、ネッパジーン(株)、千葉)を用いて電気融合させ、4倍体胚を作成した。電気融合に成功した胚を選別し、CZB培地にて一晩培養した。
小保方さんが理研に来る前にこのラボではこんなことをしてたんだねエ。
小保方さんがきてからも彼が顕微授精してたのを見たんだね。嘘でなければ。
見てもないことを空想で書くって、まずそれを思いつくことが大変だろうね。
もっともこんなふうな論文を読んでいれば創作は可能かも知れないが。
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