[連投3]
まず①に関しては、これを主張しているのは桂報告書で<当事者は>調査チームであって、決して<沈黙して>いません。ご承知の通りBCA報告に至ってはタイトルがSTAP cells are derived from ES cellsとそのものです。調査チームの調べた細胞同士の関係は以下であったと主張しています。
①FLS→FES1(太田さんが実験にも使用せず作ってみたとされている岡部マウスとのF1由来受精卵ES細胞)
②GLS→GOF-ES(学生が小保方さんに渡したntES)
③CTS→FES1(太田さんが実験にも使用せず作ってみたとされている岡部マウスとのF1由来受精卵ES細胞)
遠藤さんの論文記載は以下だ。
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the FI‐SC population originated from two cell types: ESC‐like cells having a B6 genetic background and TSC‐like cells having a genotype similar to that of CD1
[連投1]
>>学さん
素晴らしい場を提供していただいて本当に感謝します。まず確認しなければならないことは、この実験は若山研で行われたものではないという事実ですね。Extended Data Figure 5-a,bの写真はOct4-GFPですね。小保方さんはOct4-GFPのESを若山研で入手はしていませんね。小保方さんが持っているのは学生が作って小保方さんがもらったと言われているOct4-GFPのntESです。さらにExtended Data Figure 5-e,fに使われているGFP/BFP共挿入マウスのESも小保方さんは若山研では入手していません。提供者は丹羽さん、もしくは笹井さんですが、ほぼ丹羽さんだと思われます。というのは公共データ登録されているTSはマウス背景がCD1と書かれていて、これは若山さんが作ったと言っている129B6F1CAGホモマウス背景のTSが分化していたため丹羽研から提供されたと報告されていますね。
[連投5]
Extended Data Figure3-bのヒートマップの下から1/3の辺りにPou5f1(Oct4)がありますね。CD45,ES,STAPの順に並んでいますが、右端のスケールで、CD45は2-4レヴェル、ESは10-12、STAPは4-6ですね。2を底とする対数表示ですから、リニアにはCD45は4-16、ESは1024-4096、STAPは16-64です。ESの0以上の発現遺伝子を真ん中に置いてESと同じ発現遺伝子に関してCD45とSTAPを比較している。これを見ると丹羽さんの後の検証確認と一致していますね。ESと比較したらSTAPは格段少ない。でも今はそのことを論じているのではなくて、Pou5f1(Oct4)はES特異的遺伝子であるが、Pou5f1(Oct4)が発現していたらESなのではないということの根拠として指摘しているんです。遠藤さんの論拠を思い出してください。TS特異的遺伝子が発現していたらTSだと言ってるんですよ。非論理も極まっている。
[連投8]
話を戻します。Extended Data Figure 5-a,b,c,dはESのOct4はJAKiの添加で消えるがFI-SCは消えないというものです。私が錯誤という言葉を使ったことが学さんの誤解を生んでいるようですが、ここの部分の本文は以下ですよね。
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However, as Fgf4-induced stem cells lay between STAP stem cells and trophoblast stem cells in the dendrogram, the possibility of contamination of STAP stem cells in the Fgf4-induced stem-cell population cannot be ruled out.
[連投10]
論文の趣旨に沿って、Extended Data Figure 5-e,fを見てみましょう。ここはいろんな人が指摘しているところですが、FI-SCのOct4-GFPはJAKiの添加で消えませんでしたよね。e,fで使われているFI-SCは無論c,dで使われたものと同じですね。白の矢印の先にFI-SCがある。矢印はブライトフィールドでの同じ位置を示していますね。eの中段はOct4-GFP細胞ですからJAKi添加前も後も光ってないといけませんね。c,dと同じ結果でないといけない。でもどちらも光ってない。最下段はどうかというと、これはブルーのフィルターなんですからどちらも緑色蛍光は見えないのが当然です。ここは問題ない。
第二レフェリーのアドヴァイスね。
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The authors suggest that STAP cell-derived TS-like cells are distinct from embryo-derived TS cells, but the data for this are not decisive and could be attributed to persistent contamination with STAP cells or ES cells (which could expain the occasional Nanog positive cells). Presence of ES cells could be excluded by culture in the presenve of JAK inhibitor, and monitored by Oct4 and Nanog immunostaining. A global transcriptome anallysis could then be performed for comparison with TS cells. Data should also be provided on Fgf4 withdrawal from the TS-like cells - does this induce the expected differentiation into trophoblast giant cells?
貼ってきたよ。
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[連絡1]
>>学さん
一日の連投量に制約があります。お返事は遅れます。ご了解願う。JAKiに関するネイチャー第二レフェリーの査読文だけ先に貼っておきます。
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The authors suggest that STAP cell-derived TS-like cells are distinct from embryo-derived TS cells, but the data for this are not decisive and could be attributed to persistent contamination with STAP cells or ES cells (which could expain the occasional Nanog positive cells). Presence of ES cells could be excluded by culture in the presenve of JAK inhibitor, and monitored by Oct4 and Nanog immunostaining.
[連絡2]
(続き)A global transcriptome anallysis could then be performed for comparison with TS cells. Data should also be provided on Fgf4 withdrawal from the TS-like cells - does this induce the expected differentiation into trophoblast giant cells?
[連投4]
第二レフェリーはSTAP細胞かES細胞がコンタミしている可能性があると言ってますね。その理由として時折Nanogの出ているデータがあると指摘している。で、もしESのコンタミならJAKiで取り除けると言ってるんですね。 could be excludedと表現している。取り除くという意味ですね。<constitutively expressed BFP (the number of plated cells was one-tenth of that of plated Fgf4-induced stem cells)>も存在していてはいけません。ただし、査読者はcouldと言ってますね。できるんじゃないかと言ってる。
[連投8]
先行する論文は参照文献で示されているが、この論文がレフェリーの言っているように、<Presence of ES cells could be excluded by culture in the presence of JAK inhibitor, >と主張しているかどうかは、我々が読んでも別問題だと分かりますが、笹井さんならもっと分かっているでしょうね。でもリジェクトされない作文が必要ですね。でも、そもそもそんなことしていいんでしょうかね。
[連投9]
学さんが先へ先へ進まれていることは承知しています。学さんらしく直感的表現で、<STAP論文を世に出すことの危険性を、なぜ、一流の学者たちが予想しなかったのか？ >と問われた真意は分かっています。アーティクルのアブストの中に以下の文章があって、彼の内心の葛藤を漏らしたものと思っています。彼は万が一に備えて自分のことを告白しているんですよね。
>>
Thus, our findings indicate that epigenetic fate determination of mammalian cells can be markedly converted in a context-dependent manner by strong environmental cues.
お答え申し上げます。多分今からでは入手困難と思います。私は2014年の事件発生当初、慶応大の吉村教授のブログでこんな流出論文がネット上に出回ってるぞと紹介されたPDFファイルのコピーを保存しています。
これは流出させてはいけないものだが、それをPDFファイル付きで出回ってるぞと知らせる行為は自分も流出拡散に協力していることなので変だなとは思いながらも本物だということはすぐにわかりました。この吉村教授の名は後に遠藤論文の謝辞 に、<I would like to acknowledge Dr Akihiko Yoshimura, Keio University, who initially suggested on his website that NGS data could be evaluated by SNP analysis.>とあることで若山さん側の関係者だと分かりました。
[連投2]
第二レフェリーがcould be excludedとアドヴァイズした言葉を笹井さんはcan be removed と言い直していますね。これはやんわりとES細胞は死滅してexcludeされたわけではないよねとレフェリーに指摘しているのに対して小保方さんはリジェンドの中でeliminatedと笹井さんの苦労を徒労にしてしまっています。cludeというのはcloseの意味のラテン語根ですね。eはex、limiはlimitの意味のラテン語根limesで、excludeとeliminateはほぼ同義だと思いますが、removeは別の場所に動かすことで、ESが死滅したというニュアンスはないですね。
[連投3]
先行論文はヤーヌスキナーゼが多能性を維持しているようだからその阻害剤を入れたら多能性細胞は分化し始めると言ってるんですね。ESであった細胞が培地から死んでexcludeされると主張しているわけではない。 元論文を押さえれば、BFPが残っていること自体は問題ではありませんね。でも小保方さんはリジェンドで<JAK inhibitor treatment assay eliminated ES cells (Oct4-GFP+) from the culture (a, b).>と書いていて、ES細胞が多能性細胞としての機能を失うという意味に受け止められないことはありませんが、同時に細胞自体が死滅するという意味が残ってしまう。またレフェリーのアドバイス<Presence of ES cells could be excluded by culture in the presence of JAK inhibitor,)も同じです。
[連投5]
この相違は胎膜(fetal membranes)と卵黄嚢(yolk sac)に関する笹井さんの書いた本文と小保方さんの書いたリジェンドにも出現していて、笹井さんは胎膜(fetal membranes)と書いていますね。
>Surprisingly, injected STAP cells contributed not only to the embryo but also to the placenta and fetal membranes (Fig. 1b and Extended Data Fig. 1a–c) in 60% of the chimaeric embryos (Fig. 1c).
[連投7]
Pub Peerの#12コメント冒頭は以下です。
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#12 Peer 5 commented 5 years ago
commented February 28th, 2014 10:04 AM and accepted February 28th, 2014 10:04 AM
The authors claim that "Surprisingly, injected STAP cells contributed not only to the embryo but also to the placenta and fetal membranes (Fig. 1b and Extended Data Fig. 1a-c) in 60% of the chimaeric embryos (Fig. 1c)." and they show the analysis of chimaeric embryos with placentas at E12.5.
[連投8]
(続き)I'm sorry to say but that is normal in E12.5 chimaeric embryos produced by injection of wt ES cells into blastocyst, since the placental FETAL blood vessels and yolk sac mesoderm cells are derived from the ES-cell derived epiblast.
[連投10]
ESのキメラ胎盤と卵黄嚢は光って当たり前だと言ってるわけですね。むしろFigure 1-aのESキメラとされているものの方が光ってないことが不思議だと。
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In that sense what is surprising to me is that in their chimaeras (fig 1a and 1c) produced by injection of GFP expressing ES cells (Rosa26GFP or CAG-GFP) into blastocyst none showed fluorescence in the placenta (fetal blood vessels) or yolk sac (yolk sac mesoderm).
[その意味で、私にとって驚くべきことは、胚盤胞へのGFP発現ES細胞(Rosa26GFPまたはCAG-GFP）のインジェクションによって作られたキメラ（図1aおよび1c）に於いて、胎盤（胎児血管）あるいは卵黄嚢（卵黄嚢中胚葉）がまったく蛍光していないことだ。]
