遠藤高帆博士の論文 - 1412748401

1：ふふふ：2014/10/08(水) 15:06:41: Quality control method for RNA-seq using single nucleotide polymorphism allele frequency

一塩基多型対立遺伝子頻度を用いたRNA-seqのための品質制御方法
89：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 11:01:01: 最初の研究でFI肝細胞を汚染する最も可能性の高い細胞型であるTS細胞は、非B6同型接合対立遺伝子よりももっと多くのヘテロ接合（B6/非B6）対立遺伝子を有していた。 FI幹細胞のSNPは、B6および129が異なるヌクレオチドを有し、かつそれぞれ、6859と7243のヘテロ接合SNPおよび24と14の非B6ホモ接合性対立遺伝子に結果された重複実験をされた対立遺伝子の中で数えられた。混入細胞の割合は遺伝子型観察によって推定することができる。なぜなら総数のピークが約10％であることが期待されているのに対して、ピークの対立遺伝子頻度が約95から96パーセントであったためである。この結果はTS細胞のマーカー遺伝子の発現と一致している。調べられたTS細胞のマーカー遺伝子の全てが約10％のTS細胞（図4A）の中で発現している。
90：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 11:02:17: 図4(省略)

原論文で確認して。
91：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 11:02:51: [図4] FI幹細胞に組み込まれたメッセンジャーRNAの検討。（A）ES細胞、TS細胞及びFI幹細胞の中のTS細胞マーカー遺伝子の発現。実線は平均のTS細胞遺伝子発現を示し、破線は平均の10％を示している。（B）B6と129が同じSNPを共有し、TS細胞はそうでない場合にDes、Grb2、Setd7、Fbxo21、およびChd4で検出されたヘテロ接合SNP。（C）TS細胞独自の対立遺伝子を有するヘテロ接合/ホモ接合のSNP分布のジーンワイズ分析。
92：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 11:03:28: B6と129由来の配列が同じヌクレオチドを持ち、かつFI幹細胞由来のものはそうでない場合のFI幹細胞独自のSNPが検討された。これらのSNPの大部分は実験で使われたTS細胞のCD1バックグラウンドと一致し、かつB6または129とは異なっていた、対応遺伝子ごとの表示（図4B）及び全SNP分析（図4C）はFI幹細胞がTS細胞独自のSNPを共有していることを示している。FI幹細胞の中に混入したTS細胞の割合が軽微だったので、TS細胞独自のSNPのほとんどがヘテロ接合として現れた。これらの結果は、RNA-seqデータが、ES細胞のような発現パターンを持つ約90％のB6細胞と、TS細胞のようなパターンを有する約10％のCD1のような細胞の、二つの主要な細胞集団からの転写物を含んでいるという見解を支持する。したがって、FI幹細胞が胎盤に貢献するという小保方ら論文の主張は臓器幹細胞であることが知られている(Tanaka et al. 1998)TS細胞の混入による間違いを根拠にしているかも知れない。
93：名無しさん：2014/11/27(木) 11:04:07: ***STAP現象の解釈

SNPを使った異数性検出はまた元の実験に汚染のあることを示唆している。遺伝子型と表現型の両方の解析はObokataらの実験で使用されたSTAP細胞が8番染色体にトリソミーを有することを暗示し、転写因子検査は13番染色体上に遺伝子の異型の発現があることを示している。トリソミー8はマウスにおいて最も一般的な染色体異常であり、第8番染色体は13番染色体の末端に融合することが報告されている (Kim et al. 2013)。これらの観察は図3（b）の仮想染色体分析の結果を説明しているかもしれない。図3で使用されたRNA-seqデータは、STAP細胞が増殖しなかった条件下で培養された、新生児マウス脾臓細胞に由来するとして注釈されている。純粋なトリソミー8を有するマウスは胎生致死であるため、この記述は、トリソミーを有する細胞の優位性とは一致しない。したがって、これは、細胞がES細胞のものと非常に類似した発現特性を保有する培養細胞であったという結論に導く。
94：名無しさん：2014/11/27(木) 11:04:40: <結論>

ここで記述されたSNP対立遺伝子頻度法は汚染検査されている細胞が共通の遺伝的背景を共有している際には、対立遺伝子頻度が汚染を検出するのに十分なだけ異ならないかもしれないという事実によって制約されている。しかし、この方法は、原理的には、多型を含むどのRNA-seqのデータにも適用可能であり、また前向きであれ遡及的であれ両方の品質管理のために、特にES細胞やiPS細胞及びそれらの派生細胞などの培養細胞を用いた研究にとって、有用であろう。
95：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:38:55: <実験手順>

***データセット

マウスバリエーションデータはサンガーマウスゲノムプロジェクト (エイチティーティーピー略sanger.ac.uk/resources/mouse/genomes/)から入手された。またバージョン137 VCF-フォーマットデータセットはdbSNP (エイチティーティーピー略ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)から検索された。
96：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:39:43: 遺伝子および含まれているエキソンの位置はiGenomes（エイチティーティーピー略illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn）から入手された。エキソンの外側にあるSNPはこのiGenomesの注釈を使用して元のVCFファイルから除外されている。従って1016227のSNPはデータセット全体のために使用されている。
97：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:40:17: この研究で調べたオリジナルのRNA-seqの実験からの生配列データはNCBIのシーケンス・リード·アーカイブ（SRA）からダウンロードされている。プロジェクトの受託番号はSRP038104である。B6マウス株から得られたマウスのゲノム配列 (version 38, mm10) はNCBI GenBankからダウンロードされ、（着色スペースFASTQファイル用に）ボウタイで造られ、または（FASTQファイル用に）bowtie2で作られたプログラムを使用してボウタイデータベースにエンコードされた。RNA-seq実験のアクセッション番号（すなわち、SRA ID）は表S1（サポート情報）に表示され、かつアーカイブシーケンスのデータ送付の漏れが無いかのチェックサムは論文の責任著者の一人である山梨大学の若山照彦教授に確認してもらっている。
98：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:42:15: ***RNA-seq分析

SRAデータベースsra-形式ファイルはsratoolkit.2.3.4-2を使ってfastq形式に変換されている。配列アライメントのためにBowtie2（バージョン2.1.0、エイチティーティーピー略bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）とtophat2（エイチティーティーピー略tophat.cbcb.umd.edu）プログラムが適用されている。この研究はメッセンジャーRNAの構造を考慮していなかったので、すべての配列は、50 bpの読み取り断片に断片化され、2つのミスマッチを許容する “–no-coverage-search -G genes.gtf”パラメータを指定してトップハットまたはtophat2を使用して整列させた。トップハットプログラムは SOLiD colored space fastq filesを分析するためだけに使用された。遺伝子発現のレベルは、（バージョン2.1.1）のcufflinksを用いて算出されたfragments per kilobase of exon per million reads (FPKM) 値で評価されている。 C ++で書かれたプログラムはBAMファイルの中のSNP対立遺伝子を検出、列挙するために開発されています。プログラムは、公開リポジトリ（エイチティーティーピー略github.com/takaho/snpexp/）で入手可能なオープンソースソフトウェアです。百万カフスを値を読み込むごと
99：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:42:48: ***SNPの識別およびヘテロ接合性のテスト

マウスゲノム上に整列した配列断片は、SNP検出および上記の計数プログラムを使って分析されている。かつ20以上のカバー率のSNPだけが残されている。 95％以上のSNPシーケンスが二本鎖上で同じだった場合、対立遺伝子はホモ接合と定義される。
100：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:43:21: B6と129との間の全ゲノムのヘテロ接合は、B6と129 との異なる対立遺伝子による上述したSNPサブセットを使用して分析されている。SNPは既知の発現特性（TS細胞特異的、ES細胞特異的、またはその他）と遺伝子型（B6型ホモ接合、129型ホモ接合またはその他）によって分類されている。SNP分布は、モンテカルロマルコフ連鎖近似に関するフィッシャーの確率検証を用いて得られたP値によって調べられている。
101：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:43:54: ***トリソミー識別のための染色体による発現解析

ES細胞（SRR1171574とSRR1171575）及びSTAP細胞（SRR1171578とSRR1171579）由来のFPKM値が算出され、全4回のオリジナルの実験における0.01以上のFPKMを有する遺伝子が選択された。染色体上に偽遺伝子を伴わない遺伝子を分類し、各染色体について同じ細胞を用いた2つの実験の平均の対数比を決定した。相対FPKM値の分布は、全体の遺伝子の平均log比に対して、一群t検定を用いて評価した。
102：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:44:33: ***MEFマーカー遺伝子

フィーダー細胞のマーカー遺伝子はジャファルシャリフ博士や磯野恭一博士によって提供されている未公開のRNA-seqデータを用いて同定されている。 ES細胞、TS細胞及びMEF（マウス胎児線維芽細胞)間の遺伝子発現の違いはcuffdiffプログラムを用いて比較されていて、MEFの中で有意に高頻度で発現された遺伝子が選択されている。サイトカインおよび細胞外マトリックス関連遺伝子をコードする遺伝子が図2Eのフィーダー細胞の特徴を説明するために選ばれている。
103：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:45:14: <謝辞>

私はまず慶應義塾大学の吉村明彦博士に謝辞をささげたい。博士は最初にウェブサイト上でNGSデータがSNP解析により評価しうると示唆された方です。理化学研究所統合生命医科学研究センターの谷内一郎博士とNyambayar Dashtsoodol博士には実験手順を解釈するための洞察力に富んだ情報を提供していただきました。同じく理化学研究所統合生命医科学研究センターの早津徳人博士には遺伝子型解析を検証するために未発表の近親交配系/非近親交配系のマウスシーケンスを提供していただきました。同じく理化学研究所統合生命医科学研究センターのジャファルシャリフ博士と磯野恭一博士にはマーカー遺伝子を特定するために未発表のトランスクリプトームデータを提供していただきました。理研の中川真一博士には私の原稿に重要なコメントを提供していただきました。そして環境資源科学研究センター (CSRS)のデビッド·ギフォード氏はテキストを編集してくれました。また特に取下げ論文の著者である山梨大学の若山照彦博士と理研CDBの丹羽仁博士にはこの原稿について論評していただいたことに感謝致します。
104：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:00:54: <参照>

Ben-David, U., Mayshar, Y. & Benvenisty, N. (2013) 　『世界的遺伝子発現プロファイルに基づく多能性幹細胞の仮想核型分類』　Nat. Protoc. 8, 989–997
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Abstract
PDF(121K)
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117：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:08:17: <サポート情報>

(ファイル名) gtc12178-sup-0001-FigS1.pdf
(書式) application/PDF
(サイズ) 265K
（説明）　図S1　小保方らの研究の中で報告された細胞株に対して得られたRNA-seqデータからの対立遺伝子分布。 CD45+細胞（灰色）、ES細胞（黄）、STAP細胞（青）、STAP幹細胞（緑）、TS細胞（オレンジ）、EpiSCs<エピプラスト幹細胞>（水色）、およびFI幹細胞の（赤）。 ES細胞、STAP細胞、STAP幹細胞、FI幹細胞、および胚盤葉上層幹細胞（EpiSCs）は129B6F1株由来のものとして、またTS細胞はCD1株由来のものとして注釈されている。
118：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:08:52: (ファイル名) gtc12178-sup-0002-FigS2.pdf
(書式) application/PDF
(サイズ) 214K
（説明）　図S2　すべての染色体の対立遺伝子頻度。すべての常染色体とX染色体上のSNPが計数され、かつそれらの分布が示されている。 CD45+およびSTAP細胞からのRNA-seqデータは図3で使用されているものと同一である。各染色体名の後の数字はそれぞれ、CD45+ rep1、CD45+ rep2、STAP rep1、及びSTAP　rep2のSNPの数である。
119：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:11:04: (ファイル名) 省略
(書式) 省略
(サイズ) 11K
（説明）表S1 本研究で用いたRNA-seqの生データ
120：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:11:47: ご注意：ワイリーブラックウェルは、著者によって提供されるあらゆる補助情報の内容や機能についての責任を負いません。（コンテンツの欠落を除く）ご質問は記事の責任著者の方へお願いします。
121：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:12:49: 以上。
122：名無しさん：2014/11/28(金) 16:13:24: 結局、どういうことが書いてあるの?
123：セント・パンテレイモン。ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:14:16: 分からん。
124：ウィキ物知りさん：2014/11/28(金) 18:42:42: 人類は全員９９．９％同じDNAの塩基配列を持ってて、これがもっと
違ってたら種が異なるということになるんでしょ。１０００分の１の
範囲内の違いが各人の個性だね。黒人と白人の違いも所詮メラニン色素の
量だけで、文化人類学的な類型認識と違って、肌の色なんて生物学的分類の
概念では一つの個性に過ぎない。もっとすごい違いも知られていて、
ある地域の人々には放射能に強いタイプがあって、こんなのは外から見たって
区別はつかないけど、肌の色と違ってすさまじい個性の違いよね。
125：名無しさん：2014/11/28(金) 18:43:22: 遠藤博士の言ってるスニップって何なのよ？
126：ウィキ物知りさん：2014/11/28(金) 18:44:43: 人類の違いって所詮ＤＮＡ配列の１０００分の1の中で起きるたんぱく質
合成の違いでしょ。でも更に狭い集団を取って、その中でＤＮＡ配列の何かが
違っている個体が1％、つまり１００人に１人あるときにそれを多型って
言うのよ。それが４種類の塩基の一つが原因で起きている多型を
一塩基性多型、スニップと呼ぶ。それよりも少ない違いは変異とか変化と
呼ぶ。
127：名無しさん：2014/11/28(金) 18:45:32: ふーーーん。
128：名無しさん：2014/11/29(土) 07:20:51: 発表があったな。
129：名無しさん：2014/11/29(土) 07:25:24: ああ、そうだね。
小保方の検証実験の「進め方」によれば
Ｏｃｔ4-ＧＦＰ陽性細胞の出現が確認されなかった場合の自動的打ち切りか、
検証事項が全部終わっちまった場合の改革推進本部への報告を経ての
継続の要否判断によるものかのいずれかでしょうね。
130：名無しさん：2014/11/29(土) 07:31:29: 何も出来なかったということはないだろうね。というのも結果発表の日時を
特定できない理由として実験データの解釈に時間が掛かるかもしれないという
理研側の説明があったらしいことを朝日を除く各紙が伝えている。
131：名無しさん：2014/11/29(土) 07:36:27: この場合は弱Ｏｃｔ4-ＧＦＰ陽性ということになって近大とおなじ結果と
推定されるけど、ただし「進め方」の趣旨には反しているね。この場合は
３月までは続けるはずなんだな。丹羽の実験は続いていくので、小保方が
何かの勘違いを納得したというのでなければ通常は継続されるはずだね。
特に、この本人による検証は疑惑がかかったときの本人の抗弁の権利でも
あるんだよね。
132：名無しさん：2014/11/29(土) 07:37:31: じゃあ、出来てる想定だとどんな解釈？
133：名無しさん：2014/11/29(土) 07:38:55: 検証項目は以下の５つでしょ。途中でやめるなら全部終わってるということになる。

①マウス組織からのＯｃｔ4-ＧＦＰ陽性細胞の出現
②Ｏｃｔ4-ＧＦＰ陽性細胞のキメラ形成能、テラトーマ形成能
③ＳＴＡＰ細胞からの、スタップ幹細胞の形成能
④ＳＴＡＰ幹細胞のキメラ形成能、テラトーマ形成能
⑤ＳＴＡＰ細胞、ＳＴＡＰ幹細胞が最終分化細胞から形成されるかどうかの検証
134：名無しさん：2014/11/29(土) 07:40:32: 小保方さんはほぼ９月から１１月の３ヶ月間実験しているので、
２０１１年１１月のキメラ成功までほぼ１ヶ月間しか掛からなかったことを
考えて、同時並行でやれる過程を考慮すると⑤のＴＳＲ再構成の確認に
２ヶ月程度かかったと思えば、確かにそんなに不思議でない日程だね。
この後は、このプロトコルに従って理研内での追試を行い、
来年度から内外の研究機関に検証をお願いするということになってるね。
135：名無しさん：2014/11/29(土) 07:42:04: どっちだろうね？
136：名無しさん：2014/11/29(土) 07:43:51: それは分からないよ。どっちの可能性もあるだろうけど
われわれは小保方擁護なんだから、後者であってほしいと
願うだけさ。
相沢の指導の下でデータを取りまとめるといってるところをどう解釈するかな？
137：名無しさん：2014/11/29(土) 07:44:57: 相沢は新しい組織の元で小保方の上司になってるからでしょ。
138：名無しさん：2014/11/29(土) 07:46:59: 無論そうなんだけどね。でも全部出来て終わっちまったとしたら
誰がキメラを作ったのかという疑問が生じるでしょ。
この場合、相沢しかいないでしょ。
139：名無しさん：2014/11/29(土) 07:48:01: そうだね、取り下げられた論文ってどうなるんだろうね？
140：名無しさん：2014/11/29(土) 07:50:30: 取り下げられたというのはもうその論文はないのよ。
だから学説発表としては新たに書かないといけないけど、別に以前の
論文をリバイズして別の雑誌にでも掲載すればいいんで、特許はもう
手続き進行中だから今回は無関係だ。
141：名無しさん：2014/11/29(土) 07:51:47: ｏｃｔ4段階でダメならもっと早く打ち切るべきでギリギリまでやる必要の意味がわからん。
改革委員会でも小保方は論文で示した通りの実験しか出来いはず。
142：名無しさん：2014/11/29(土) 07:52:14: でも、写真は全部今回の新しい実験のときのデータに差し替えられてしまうんだね。
若山ｘｙの撮った写真は外されてしまう。
論文の著者にも入らないということ？
143：名無しさん：2014/11/29(土) 07:56:41: そういう問題が又いろいろと出てくるだろうから
いまから調整しないといけないだろうね。
ただ、成功していたら若山さんにもかかっていた嫌疑も消えるわけだから
全体としては言い話で決着することになる。
今、理研の竹市さんの研究室のホームページで笹井さんの追悼企画を
掲載してるでしょ。なんとなく流れは感じてたんだけどね。
144：名無しさん：2014/11/29(土) 07:59:09: まだわからないね。
推測に過ぎない。
いずれにせよ、この遠藤論文の検討は続けないといけないね。
どっちに転んでもこれが問題になる。
145：名無しさん：2014/11/30(日) 04:38:13: 一応、データとして残しておきましょう。

ＳＴＡＰ細胞:理研、小保方氏の実験３０日に終了
毎日新聞　2014年11月28日　23時02分（最終更新　11月29日　09時54分）
理化学研究所は２８日、ＳＴＡＰ細胞の有無を調べる検証実験のうち、
小保方晴子氏による実験を当初の予定通り３０日で終えると明らかにした。
実験の結果はデータがまとまり次第公表する方針。しかし実験データの
解釈に時間を要する可能性があり、公表時期は未定としている。
小保方氏は実験の終了後、検証チームを率いる相沢慎一氏らの指導を
受けながら、得られたデータの整理や解析を担う。
検証チームは８月、小保方氏らが発表した論文に記載された手法では、
ＳＴＡＰ細胞は再現できていないとする中間報告を発表。当初から進捗
（しんちょく）状況にかかわらず１１月末で小保方氏の実験を打ち切ると
していた。（共同）
146：名無しさん：2014/11/30(日) 04:39:25: 相沢氏の指導を受けながら得られたデータの整理や解析を行なうというのは
意味深ですね。
弱オクト4発現の解釈ではありませんね。
もしそうなら、今まで強発現していた細胞は何であったのか、若山氏に
渡してキメラ成功した細胞は何だったのかが直ちに問題にならなければ
なりませんから、意味の無い実験のデータの解釈なんかしている場合では
ありませんね。その場合はデータを整理する必要すらありません。

全部出来てしまったと考えるのが一番自然です。
その中に解釈を要するものがあるということです。
147：名無しさん：2014/11/30(日) 04:39:55: できてたとしたら黒田論文はこれから検証されなければなりませんね。
でも、その前に、小保方さんはどんな実験をしていたのでしょうかね。
もう一度丹羽さんのプロトコルに戻って想像してみましょうか。
セント・パンテレイモン・ふふふ三世さん、お願いします。
148：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:40:32: ええっ、又かい。でもどうせまだ時間が掛かるみたいだから
暇つぶしにいいかな。
149：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:41:18: 体細胞からのSTAP細胞変換培養に欠かせない技術上の秘訣
Haruko Obokata,
Yoshiki Sasai
& Hitoshi Niwa
STAP Group RIKEN CDB
Journal name:
Protocol Exchange
Year published:
-2014
DOI:
doi:10.1038/protex.2014.008
Published online
5-Mar-14
150：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:41:52: 要約
手順
参照
関連著作物
著者紹介

本論文が取り下げられていますので、作者らはこのプロトコルイクスチェンジのプロトコルを取り下げています。
151：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:42:27: ＜要約＞
刺激惹起性多能性獲得（STAP）は最近2つの論文で報告された細胞の再プログラミング現象である (Obokata, Nature, 2014a,b)。この再プログラミングプロセスでは、強力な外部刺激に応じて、新生児の体細胞が、Oct3/4のような多能性関連遺伝子を発現し、体外体内および体内で、三胚葉すべての派生物に分化する能力を獲得した細胞に変換される。、STAP細胞と定義されたこれらの細胞は胚盤胞注入後にキメラ胎児に寄与することができる。それにとどまらず、胚盤胞注入試験において、注入されSTAP細胞はまた胎盤などの胚の外部組織においても見出される。
152：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:43:01: 新生児の体細胞に由来するSTAP細胞はこのように多能性状態に完全に再プログラムされている。 STAP細胞の樹立のための条件下では、それらの増殖能力は、胚性幹細胞（ESCｓ）のものとは異なり、非常に制限されている。 STAP細胞はさらに二つのタイプ増殖性細胞株に変換することができる。STAP幹細胞およびFGF4誘発性幹細胞（FI幹細胞）である。ACTH含有培地の中で（手順参照）、STAP細胞から変換されたSTAP幹細胞は、胚の外部組織に貢献する能力を失う。FGF4含有培地中の中でSTAP細胞から生成されたFI幹細胞は、それらの胚への寄与は比較的低いが、胚盤胞注入検査で、胚および胚の外部系統の両方に貢献する能力を保持する。
153：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:43:36: 外部刺激によって誘導されるSTAP現象は潜在的に哺乳動物細胞における多能性および分化に関する我々の理解に新たな光を投げかけるものである。この予期しない現象は例えば低pH溶液に過渡の曝すことによって新生児の造血細胞で惹起されうるものである。その見かけの単純さにかかわらず、この手順では細胞の取り扱いや培養条件のみならず、最初の細胞集団の選択にも特別な注意が必要である。細胞に最適レベルの亜致死刺激を与えることがSTAP細胞誘導の過程に不可欠である。我々の経験では、STAP変換はほとんどの細胞が低pH処理後一日生存し、その後初期細胞数の80％までが2から3日位で死亡するような培養条件で再現的に見られる。溶液のpHの調整だけが重要な要因ではなく、亜致死ストレスの遅発性も非常に重要である。
154：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:44:12: この生物学的状況はまた他の多くの要因によっても影響され得る。例えばストレスにさらす前後の体細胞の準備と取り扱いは、過剰な細胞死か、不十分な惹起性が引き起こされた場合に、細胞への追加ダメージがストレスレベルを変更することができるように、注意深く行なわれなければならない。STAP変換に使用される細胞のタイプも重要であり、他のソースからの細胞の使用（例えば、継代後の培養線維芽細胞の使用）もSTAP変換を達成するために障害をもたらし得る。適切な手順が正しい順序で行なわれている場合に我々はSTAP細胞の変換を再現的に観察している。
155：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:45:01: この技術の広範なテストと使用を容易にするために我々は今、ステップバイステップ手順の完全なプロトコル論文を準備中です。しかしながら、完全な原稿の作成、提出、公表にはかなりの時間がかかるので、我々は、このProtocol ExchangeでSTAP細胞の変換培養（および関連の実験）のための多くの技術的な秘訣を共有したいと思います。我々はこれらの技術的な秘訣が実験の詳細についてしばしば問われる多くの質問に答えることになることを願っています。
156：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:26:32: ＜手順＞
***組織収集および低pH処理
1.　CD45陽性造血細胞を単離するために、1週齢のOct4-GFPマウス（特に指定のない限り）から脾臓が摘出され、ハサミによりミンチされ、そして機械的にパスツールピペットを用いて分離される。
[重要]
(i) 接着細胞は機械的または酵素的に（トリプシンまたはコラゲナーゼにより）単一細胞に解離されなければならない。図3ａ (Obokata et al. Nature, 2014a)で説明されている組織のうち、他の細胞が機械的に解離させられたのに対して、筋肉、脂肪組織および線維芽細胞は酵素的に解離させられている。
157：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:27:23: (ii)一次細胞が使用されるべきである。我々は新鮮なマウス胚線維芽細胞（MEF）なら可能であるが、体外で増殖されたMEFを再プログラムすることは困難であることをすでに知っている。
(iii) 報告されている実験のために、我々は、理化学研究所バイオリソースセンターによってGOF18-GFP株11トランスジェニックマウス(B6;B6D2-Tg(GOF18/EGFP)11/Rbrc)として維持されている、Oct-3/4-EGFPトランスジェニックマウス株を使っている(Ohbo et al, Dev Biol, 2003; Yoshimizu et al, Dev Growth Differ, 1999)。導入遺伝子のホモ接合体は、強化された信号を得るため、ライブイメージング用に使用されている。
(iv)1週間以上経過したマウス由来の細胞は現在のプロトコルの下では非常に貧弱な再プログラミング効率を示した。雄の動物からの細胞は雌からのものよりも高い効率を示している。
158：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:27:55: 2.　解離脾臓細胞をPBS＜リン酸緩衝生理食塩水　Phosphate buffered saline＞で懸濁し、細胞濾過器（BD Biosciences社352340）で漉した。
3.　1000回転/分で５分間遠心分離した後、回収した細胞をDMEM培地＜ダルベッコ変法イーグル培地　Dulbecco's modified Eagle medium＞に再懸濁し、同じ体積のヒトリンパ球分離性溶液＜lympholyt＞（セダレーン社）を添加し、次いで20分間1000ｇで遠心分離した。
159：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:28:29: [重要]
（i）出発細胞の純度はSTAP変換を達成するために重要である。リンパ球にとって赤血球の混入が再プログラミング事象を阻害することがある。接着細胞を用いる場合には細胞外基質の存在が再プログラミングを妨害することがある。
（ii）代替手段として1.8 mlの水（シグマ社W3500）の中に細胞ペレットを懸濁することによって赤血球を除去してもよい。30秒後に、10倍濃度のPBS＜リン酸緩衝生理食塩水＞（ギブコ社70011-044）を0.2mlを、続いて１倍濃度のPBS（ギブコ社10010-023）3mlを加えて、細胞濾過器を通して細胞懸濁液を濾過する。
160：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:29:07: 4.　リンパ球層を単離し、CD45抗体（Abcam社のab25603）で染色した。 CD45+細胞をFACSアリア（BD Biosciences社）によって選別した。
[重要]
（i）　FACSソーティングは細胞の純度を確保するための重要なステップであり得るが、細胞の生存率と初期化効率の両方に影響を与えうる。細胞出自の信頼性を減少させるかもしれないが、このステップをスキップすると初期化効率を高めることができる。
161：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:29:42: 5.　細胞選別後、１００万個のCD45陽性細胞を37℃で25分間、低pH（塩酸によりpHを5.7に滴定）のHBSS＜ハンクス平衡塩溶液溶液＞500μlで処理し、次いで室温で1000rpmで5分間遠心分離した。
[重要]
（i）HBSSの緩衝作用が弱いため、溶液のキャリーオーバーがpHに影響する可能性がある。以下の方法に従ってpHを5.7に調整してください。まず、事前に4℃に冷却されたHBSS494μlに細胞ペレットを懸濁し、次に、5.7の最終pHに調整するために希釈塩酸（HBSS590μlに35％塩酸を10μl）を6μl追加する。パイロット実験で最終pHを確認し、加える塩酸の量を必要に応じて最適化してください。そうでなければ、事前に4℃に冷却されたHBSS-pH5.4に細胞ペレットを懸濁してください。
162：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:30:18: (ii)我々の使用したHBSSはCa2+/Mg2+ free（ギブコ社14170-112）である。
(iii)炭酸ガス培養器内でHBSSに懸濁した細胞を培養してください。
（iv）細胞生存率はこの行程における重要なパラメータである。図1dに示すように、最適な条件下で、大量の細胞死がプレーティング後2日目に観察される (Obokata et al. Nature, 2014a)。
(v)プレーティング後一日目で大量の細胞死があった場合は、低pHのHBSS溶液での培養期間を15分に短縮することによって改善することができる。
163：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:30:51: 6.　上澄み（低pH溶液）を除去した後、沈殿細胞を再懸濁し、千U LIF（シグマ社）と2％のB27（インビトロジェン社）を入れたDMEM / F12培地の中の非接着性培養プレートに播種する（通常、１０万個細胞/ ml）。
[重要]
(i)非接着性培養プレートの使用が推奨される。なぜなら、細胞クラスターの形成は再プログラミングのための重要なステップであるが、接着性表面は、クラスタを形成するのに必要な細胞の移動を阻害しうるからである。
164：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:31:26: （ii）細胞密度は重要であり、それは細胞生存率に依存している。密度は培養表面1平方センチメートルあたり１０万から１００万個の細胞で維持されるべきである。
(iii)B27（インビトロジェン社17504-044）は商品バッチ間で違いのあることがある。 ES細胞のN2B27-2iLIF培養によって品質を確認してください。
7.　細胞のクラスター形成はOct3/4-GFP陽性細胞のパーセンテージに対してよりも、プレート移植されている細胞密度に対してより敏感であった。生存細胞数はドナーマウスの年齢に敏感であり、成長したマウス脾臓を用いた場合、上述した処理条件下で低かった。
165：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:31:58: [重要]
(i)ドナーマウスは1週齢もしくはもっと若くあるべきである。高齢の動物からの細胞を用いると再プログラミング効率は劇的に落ちる。
（ii）STAP細胞は複数の細胞のクラスタから誘導される。それらは単一種細胞ではない。
166：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:32:32: ８.　2から7日目のにおけるのLIFの添加は、拡張データ図1ｆに示すように、7日目のOct3/4-GFP陽性STAP細胞クラスターを生成するために不可欠であった(Obokata et al. Nature, 2014a)。LIFの存在しない場合でも、Oct3/4-GFP陽性細胞（ほとんどが薄暗いシグナルを示したが）は培養2から5日の間に、低pH値で処理したCD45陽性細胞の中に一過的に現れたが、その後に姿を消した。LIF依存の次の段階に対してＬＩＦ非依存の初期段階のあることを示唆している。
167：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:33:02: [重要]
(i)再プログラミングの後期段階ではLIFは不可欠ですので、再プログラミング事象は遺伝的背景に依存しているのかも知れない。我々は主に129、C57BL6、またはそれらのF1株を使用したが、これらの遺伝的背景のすべてがLIFへの高い応答性に関連しているからである。
(ii) GFPシグナルは、同じレポーターを持っているES細胞のそれより弱いが、それは図1ｇに見られるように、STAP細胞の体積がES細胞よりも小さいためである(Obokata et al. Nature, 2014a)。
168：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:23:12: ***STAP幹細胞変換培養
1. STAP幹細胞株を確立するために、 STAP細胞クラスターはMEFフィーダー細胞上のACTH含有培地に移される。（96ウェルプレートの1ウェルあたり１ダースまでの複数のクラスタ）
169：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:23:46: [重要]
(i)ACTH（1-24）は、アメリカンペプチド社および他の会社から入手可能である。我々は委託契約でクラボウによって合成されたACTHを使用していた。この培地の組成は、GMEM、15％ノックアウト血清代替TM（KSR、Invitrogen社）、1×非必須アミノ酸（NEAA）、1×ピルビン酸ナトリウム、10 -4 M2-メルカプトエタノール、1000U / mlのLIF、および10μM　ACTHである　(Ogawa et al, Genes Cells, 2004)。 STAP細胞のクラスターは図4a (Obokata et al. Nature, 2014a)にしめされた胚盤胞注入の場合のように単離され小片に切開され、ACTH培地中のマウス胚線維芽細胞フィーダー細胞上に播種された。
(ii)ACTH含有培地はステムミージャムアドレスのDSファーマバイオメディカル社（大阪、日本）から購入されている。
170：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:24:19: 2.　培養の2から7日後に、細胞は従来のトリプシン法を使って第一段階に供され、懸濁した細胞を、20％FBS＜ウシ胎児血清　fetal bovine serum＞を含むES細胞維持培地に蒔種された。
[重要]
（i）ES細胞維持培地は KnockoutTM DMEM＜イーグル最小必須培地＞（Life Technologies社）、20％FBS、1×NEAA、1×グルタミン、1×ヌクレオシド、10 -4M　2-メルカプトエタノール及び1000 U/mlのLIFから構成されている。
（ii）のFBSロットは、マウスES細胞の培養に使用するための適合性が確認されるべきである。
171：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:24:52: （鄴）我々はCD45陽性造血細胞に由来するSTAP細胞から複数のSTAP幹細胞株を確立している。調べた8個のクローンのうちのいずれも再構成されたTCR対立遺伝子を含んでいなかった。このことはSTAP細胞が変換プロセスでSTAP幹細胞になるための、（もとの細胞の突然変異含む）陰性の細胞型依存バイアスの可能性を示唆している。これは現在のプロトコルにおいて、非新生細胞をもとの体細胞として使用したときに、STAP細胞の変換がそれほど効率的でなかったという事実に関係しているかも知れない。
172：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:25:27: 3.　その後の継代はサブコンフルエント（シャーレ一杯になる前）に達するまでの二日置きに、1対10の分割比で行なった。我々はSTAP細胞クラスターからSTAP幹細胞を樹立するために、マウスの以下の3つの異なる遺伝的背景をテストし、再現性の確立を観察した。Oct4-GFP（29の29）を持つC57BL/6、Rosa26-GFP（2の2）をもつ129/ SV、および129/ CAG-GFP（16の12）をもつSV×C57BL/6。すべてのこれらの遺伝的背景を持つSTAP幹細胞はキメラ形成活性を示した。
173：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:25:59: ***FI幹細胞変換培養
1. STAP細胞クラスターがFGF4を含む96ウェルプレート中のMEFフィーダー細胞上のＴＳ細胞＜栄養芽層幹細胞＞培地 (Tanaka et al, Science, 1998)に移される (Obokata, Nature, 2014b)。
[重要]
（i）TS培地は20％のFBS＜ウシ胎児血清＞を含むRPMI1640＜ロズウェルパーク記念研究所培地　Roswell Park Memorial Institute medium＞、1mMのピルビン酸ナトリウム、100μMの2-メルカプトエタノール、2mMのL-グルタミン、組換えFGF4の25 ng / ml及びヘパリンの1μg/mlで構成されている。
(ii)FBSのロットの違いは培養細胞の挙動に重大な差異をもたらしうる。
174：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:26:38: 2.　ほとんどの場合（40から50回の実験）、コロニーは96ウェルプレートのウェルの10から50％までに成長した。少数の例（50のうちの１０回の実験）では、全くコロニー増殖が観察されずに、かつ/または、わずかの線維芽細胞様細胞が出現した。
重要
(i)増殖コロニー内の細胞はまた線維芽細胞のように現れるが、徐々に形態を変更して上皮細胞に似てくる。
175：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:27:14: 3.　細胞を従来のトリプシン法を用いて7-10日間の最初の継代に供した。それらがサブコンフルエントに達する前に３日おきに４対１の分割比でその後の継代を行った。
[重要]
(i) 細胞は完全に解離されてはいけない。胚由来のトロホブラスト幹細胞の場合に見られるように、部分的な解離が生存能力および自己再生を維持するのに最適である。
176：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:27:47: ＜参照＞
Obokata, H. et al.Obokata.　『体細胞の多能性への刺激惹起性運命変換』Nature, 505, 641-647 (2014a)
Obokata, H. et al.　『取得多能性を持つ再プログラム細胞における双方向への発生能力』 676–680 (2014b)
Ohbo, K. et al.　『マウスの小さな星の中に満たされた思春期前の精子形成における幹細胞の同定と特徴づけ』　Dev. Biol. 258, 209–225 (2003)
177：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:28:21: Yoshimizu, T. et al.　『マウスのOct4/緑色蛍光タンパク質（GFP）導入遺伝子の生殖細胞特異的発現』　Dev. Growth. Differ. 6, 675-684 (1999)
Ogawa, K., Matsui, H., Ohtsuka, S. & Niwa, H.　『マウスES細胞のクローン増殖を調節するための新しいメカニズム』　Genes Cells 9, 471–477 (2004)
Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. & Rossant, J.　『FGF4＜線維芽細胞増殖因子＞によるＴＳ細胞増殖の推進』　Science 282, 2072–2075 (1998)
178：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:28:55: ＜関連著作物＞
このプロトコルは下記論文に関連している。
『体細胞の多能性への刺激惹起性運命変換』
Haruko Obokata, Teruhiko Wakayama, Yoshiki Sasai, Koji Kojima, Martin P. Vacanti, Hitoshi Niwa, Masayuki Yamato, and Charles A. Vacanti
Journal title
Nature
Vol.
505
Issue
-7485
Pages
641 - 647
Publication date
29/01/2014
DOI:
doi:10.1038/nature12969
179：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:29:33: 『取得多能性を持つ再プログラム細胞における双方向への発生能力』
Haruko Obokata, Yoshiki Sasai, Hitoshi Niwa, Mitsutaka Kadota, Munazah Andrabi, Nozomu Takata, Mikiko Tokoro, Yukari Terashita, Shigenobu Yonemura, Charles A. Vacanti, and Teruhiko Wakayama
Journal title
Nature
Vol.
506
Issue
-7484
Pages
677 - 680
Publication date
29/01/2015
DOI:
doi:10.1038/nature12970
180：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:30:06: ＜著者紹介＞
［所属］
1.細胞リプログラミング研究室、理研CDB
小保方晴子
2.器官発生・神経発生研究室、理研CDB
笹井芳樹
多能性幹細胞解明研究室、理研CDB
丹羽仁
［金銭的利益相反］
著者等は金銭的利益相反のないことを宣誓します。
［責任著者］
連絡はこちらへ
丹羽仁（アドレス）
181：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:30:39: 以上
182：名無しさん：2014/12/02(火) 07:31:10: 何が書いてあったの？
183：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:32:18: よくわかんないけど小保方さんがＥＳ細胞を持っていた理由は分かった。
184：名無しさん：2014/12/02(火) 07:32:49: なんでなの？
185：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:34:41: 培地の有効性を試験するためもあるみたいだね。
購入した薬剤はロットによって微妙に違うんで
ＥＳで試験してみたりするらしいな。
186：名無しさん：2014/12/02(火) 07:35:55: 結局プロトコル読み直してみてどうなのよ。
どんな実験なの？
187：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:38:47: そんなに単純な手技じゃないということはこれだけでも分かるね。
でも疑う人が読めばヤッパリ疑えるんでどうにでも読み取るでしょうね。
188：名無しさん：2014/12/02(火) 07:40:35: 遠藤論文はどうするの？
素人では歯が立ちそうもないね。