SRAデータベースsra-形式ファイルはsratoolkit.2.3.4-2を使ってfastq形式に変換されている。 配列アライメントのためにBowtie2(バージョン2.1.0、エイチティーティーピー略bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml)とtophat2(エイチティーティーピー略tophat.cbcb.umd.edu)プログラムが適用されている。この研究はメッセンジャーRNAの構造を考慮していなかったので、すべての配列は、50 bpの読み取り断片に断片化され、2つのミスマッチを許容する “–no-coverage-search -G genes.gtf”パラメータを指定してトップハットまたはtophat2を使用して整列させた。トップハットプログラムは SOLiD colored space fastq filesを分析するためだけに使用された。遺伝子発現のレベルは、(バージョン2.1.1)のcufflinksを用いて算出されたfragments per kilobase of exon per million reads (FPKM) 値で評価されている。 C ++で書かれたプログラムはBAMファイルの中のSNP対立遺伝子を検出、列挙するために開発されています。プログラムは、公開リポジトリ(エイチティーティーピー略github.com/takaho/snpexp/)で入手可能なオープンソースソフトウェアです。百万カフスを値を読み込むごと
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Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A.K., Nagy, A. & Rossant, J. (1998) 『FGF4による栄養膜幹細胞増殖の促進』 Science 282, 2072–2075
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(ii)一次細胞が使用されるべきである。我々は新鮮なマウス胚線維芽細胞(MEF)なら可能であるが、体外で増殖されたMEFを再プログラムすることは困難であることをすでに知っている。
(iii) 報告されている実験のために、我々は、理化学研究所バイオリソースセンターによってGOF18-GFP株11トランスジェニックマウス(B6;B6D2-Tg(GOF18/EGFP)11/Rbrc)として維持されている、Oct-3/4-EGFPトランスジェニックマウス株を使っている(Ohbo et al, Dev Biol, 2003; Yoshimizu et al, Dev Growth Differ, 1999)。導入遺伝子のホモ接合体は、強化された信号を得るため、ライブイメージング用に使用されている。
(iv)1週間以上経過したマウス由来の細胞は現在のプロトコルの下では非常に貧弱な再プログラミング効率を示した。雄の動物からの細胞は雌からのものよりも高い効率を示している。
[重要]
(i)再プログラミングの後期段階ではLIFは不可欠ですので、再プログラミング事象は遺伝的背景に依存しているのかも知れない。我々は主に129、C57BL6、またはそれらのF1株を使用したが、これらの遺伝的背景のすべてがLIFへの高い応答性に関連しているからである。
(ii) GFPシグナルは、同じレポーターを持っているES細胞のそれより弱いが、それは図1gに見られるように、STAP細胞の体積がES細胞よりも小さいためである(Obokata et al. Nature, 2014a)。
***FI幹細胞変換培養
1. STAP細胞クラスターがFGF4を含む96ウェルプレート中のMEFフィーダー細胞上のTS細胞<栄養芽層幹細胞>培地 (Tanaka et al, Science, 1998)に移される (Obokata, Nature, 2014b)。
[重要]
(i)TS培地は20%のFBS<ウシ胎児血清>を含むRPMI1640<ロズウェルパーク記念研究所培地 Roswell Park Memorial Institute medium>、1mMのピルビン酸ナトリウム、100μMの2-メルカプトエタノール、2mMのL-グルタミン、組換えFGF4の25 ng / ml及びヘパリンの1μg/mlで構成されている。
(ii)FBSのロットの違いは培養細胞の挙動に重大な差異をもたらしうる。
<参照>
Obokata, H. et al.Obokata. 『体細胞の多能性への刺激惹起性運命変換』Nature, 505, 641-647 (2014a)
Obokata, H. et al. 『取得多能性を持つ再プログラム細胞における双方向への発生能力』 676–680 (2014b)
Ohbo, K. et al. 『マウスの小さな星の中に満たされた思春期前の精子形成における幹細胞の同定と特徴づけ』 Dev. Biol. 258, 209–225 (2003)
Yoshimizu, T. et al. 『マウスのOct4/緑色蛍光タンパク質(GFP)導入遺伝子の生殖細胞特異的発現』 Dev. Growth. Differ. 6, 675-684 (1999)
Ogawa, K., Matsui, H., Ohtsuka, S. & Niwa, H. 『マウスES細胞のクローン増殖を調節するための新しいメカニズム』 Genes Cells 9, 471–477 (2004)
Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. & Rossant, J. 『FGF4<線維芽細胞増殖因子>によるTS細胞増殖の推進』 Science 282, 2072–2075 (1998)
<関連著作物>
このプロトコルは下記論文に関連している。
『体細胞の多能性への刺激惹起性運命変換』
Haruko Obokata, Teruhiko Wakayama, Yoshiki Sasai, Koji Kojima, Martin P. Vacanti, Hitoshi Niwa, Masayuki Yamato, and Charles A. Vacanti
Journal title
Nature
Vol.
505
Issue
-7485
Pages
641 - 647
Publication date
29/01/2014
DOI:
doi:10.1038/nature12969