遠藤高帆博士の論文 - 1412748401

1：ふふふ：2014/10/08(水) 15:06:41: Quality control method for RNA-seq using single nucleotide polymorphism allele frequency

一塩基多型対立遺伝子頻度を用いたRNA-seqのための品質制御方法
59：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/25(火) 07:10:08: RNA-seqの中の対立遺伝子頻度はインプリント遺伝子を検出するために使用されてきている(DeVeale et al. 2012; Lagarrigue et al. 2013)。ここで説明するアプローチはヘテロ接合のSNPを用いたRNA-seqの研究の中で、汚染細胞汚検出のためのバリエーションデータベースの適用を拡張します。さらに、このアプローチは、染色体異常を検出する方法をも提供します。特定の染色体におけるゆがんだ対立遺伝子頻度は異数性によって引き起こされ得ます。異数性は多様なタイプの異常を引き起こしうるので、異数性が標的組織に期待されていない場合、我々は研究における異常細胞からのデータを除外することができる。
60：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/25(火) 07:10:51: この方法は遡及的に実験品質を評価するために適用可能であると同時に、明らかに再現性がない結果を解釈するのに便利です。
61：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/25(火) 07:12:04: <結果と検討>

***数理モデルとシミュレーション

二倍体細胞は相同染色体のペアを持っています。遺伝子は、インプリント遺伝子の場合と性染色体上の遺伝子を除き、父方と母方の染色体からおよそ同一の頻度で提供されている(DeVeale et al. 2012; Lagarrigue et al. 2013)。片親からの配列の発現頻度は、二項分布に従う見込みによって期待されている。 PCR増幅に起因するバイアスがこの分布に影響を与える可能性があるため、PCRバイアスの影響を調べた。ヘテロ接合のSNPを有するノンインプリンティング遺伝子を考える際、対立遺伝子頻度は、ひとつの細胞型で構成されたサンプルの約50%であると予測され、かつ汚染によって引き起こされた特定のSNPのアンバランスな表現は分布ピークのシフトとして表われてくるはずです。
62：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/25(火) 07:12:39: 混入細胞が対立遺伝子頻度の単純な二項分布にどのように影響するかを図示するためにシミュレーションが実施された。参照対立遺伝子（A）の数をnA、代替対立遺伝子（a）のそれをnaとするとき、参照対立遺伝子の検出の可能性はnA /（nA+ na）である。 RNA-seqの実験では、PCRから生じるバイアスを考慮しなければならない。モデルを単純化するために、PCRバイアスはA及びaを含む配列がそれぞれ、2のα乗と2のβ乗倍に増幅されたと仮定して組み込まれた。もし我々がRNA-seqの持つ遺伝子座のN断片を得た場合は、k個の参照対立遺伝子配列の確率は次のように計算される。
63：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/25(火) 07:15:36: くそっ、算式が貼り付けられない。表示方法も分からない。
原論文で確認して。

算式1(省略)

仮にPを以下のように置く。

算式2(省略)
64：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/25(火) 07:16:16: 図1AのシミュレーションはN= 50で、かつ標準偏差が0（無PCRバイアス）または1（PCRバイアス）を有するガウス分布に従ったβ－α条件を用いて行った。シミュレーションは分布の分散がPCRバイアスに依存的であったこと、分布様式が対立遺伝子の組成に対応していることを示した。公開データベースから得られた様々な細胞型からRNA-seqのデータのいくつかのセットの対立遺伝子頻度を調べた結果、シミュレーション（図1B）と一致した。 0％と100％でのピークは観察された細胞内のホモ接合のSNPに起因する可能性があります。人工汚染状況はまた2つのセルのカテゴリからのRNA-seqのデータセットのランダムサンプリングによって作られています。それは純粋なC57BL / 6（B6）の造血幹細胞（HSC）と各種129及びB6胚性幹細胞（129B6F1のESC）の各種比率の混合物の二つです。数学的シミュレーション（図1C、灰色の線）のように曲線形状とピーク位置はその比率に沿って変化しています。
65：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/25(火) 07:17:46: フィギャー1も貼り付けられない。
原論文で確認して。

図1(省略)
66：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/25(火) 07:18:32: [図1] RNA-seqデータの対立遺伝子頻度解析。（A）修正された二項分布を用いたSNPの対立遺伝子頻度のシミュレーション。ピーク位置は、2つの対立遺伝子組成物により決定され、分布の分散はsd、即ちシミュレートされたPCRバイアスの標準偏差に依存している。（B）いくつかの細胞型におけるSNP分布。ESCｓ＜ＥＳ細胞＞（赤、SRR1047502、129B6F1背景）、線維芽細胞から誘導されたｉPSｓ＜ｉＰＳ細胞＞（黄色、SRR1047504、129B6F1）、MEF＜マウス胎児線維芽細胞：フィーダー細胞＞（青、SRR104220、129B6F1）、正常な線維芽細胞（ＮＦｓ；緑、SRR1191170、B6 X　BALB/ ｃ）、癌化した線維芽細胞（CAFｓ；紫、SRR1191171、B6　x BALB　/ c）及びHSCｓ＜造血幹細胞＞（灰色、SRR892995、B6）。各細胞型のために適用されたSNPの数は各ボックス内の括弧内に示されている。（C）示されたＥＳ細胞の異なる割合で汚染された造血幹細胞資料の対立遺伝子頻度。
67：名無しさん：2014/11/25(火) 07:23:58: >>39

訳してる人はふふふ3世なので、代々素人だから、当然何が書かれているのか
全く理解して無い。ここまでのところ添削と解説と精査お願いします。

次回は{***STAP論文の再解析: 線維芽細胞増殖因子によって誘導される幹細胞（FI-SC）の遺伝子型解析}

から続きます。それまでよろしく。
68：名無しさん：2014/11/25(火) 07:36:25: 60のところ遠藤さんの論文の目的は二股かけてるよね。
69：名無しさん：2014/11/25(火) 07:37:36: ちゃんとさげろよ。
70：名無しさん：2014/11/27(木) 09:31:35: ***STAP論文の再解析: 線維芽細胞増殖因子によって誘導される幹細胞（FI-SC<FI幹細胞>）の遺伝子型解析
71：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 09:33:03: ***STAP論文の再解析: 線維芽細胞増殖因子によって誘導される幹細胞（FI-SC<FI幹細胞>）の遺伝子型解析

この研究はRNA-seqデータの中のSNP対立遺伝子頻度がいかにしてデータセットのプロパティを表示しうるに至るのかを検討している。小保方らは最近STAP現象を報告した。それは胚盤胞に注入された場合に胚および胎盤組織を作り出すことができる多能性幹細胞へと変化した体細胞の誘導細胞再プログラミングを意味する(Obokata et al. 2014a,b）。上述の対立遺伝子頻度のアプローチは研究者らによって提供されているNGSデータセットを調べてきたものである。参照対立遺伝子（dbSNPのB6遺伝子型に相当）と、代替の対立遺伝子（この研究では129の遺伝子型に対応する）間の対立遺伝子頻度は、TruSeq試薬を使用して得られた7回の反復実験から得られたRNA-seqデータの中で検討されている（サポート情報の図2AおよびS1）。
72：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 09:33:37: 7回の実験中6回の対立遺伝子分布は図 1Aで期待されている親の染色体と同じ表現を示した。ES細胞、STAP細胞、およびSTAP幹細胞（STAP-SCS）を含む実験では全くの0％のピークは無かったが（サポート情報の図S1）、おそらく細胞が実験室で戻し交配されたため、公開データベース (J. Sharif and K. Isono, personal communication)のものとは異なる遺伝子型のマウスから得られたからであろう。
73：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 09:34:50: 図2(省略)

原論文で確認して。
74：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 09:35:34: [図2] 汚染を示すFI幹細胞のmRNAで検出されたSNP。（A）STAP論文に使用されたES幹細胞とFI幹細胞のRNA-seqの実験から得られた対立遺伝子分布。ES幹細胞（青）とFI幹細胞（赤）の両方とも129B6F1遺伝子背景を有していると注釈されている。各実験のために適用されたSNPの数は、ボックス内の括弧で示されている。（B）ES幹細胞で高頻度で発現されるSall4及びKlf4で検出されたSNP。 B6型対立遺伝子は青で、129型対立遺伝子（すなわち、非B6）は黄色で示されている。（C）TS細胞特異遺伝子Elf5及びSox21で検出されたSNP。（D）元の論文で使用された幹細胞で観察された沢山のホモ接合/ヘテロ接合SNP。 FI肝細胞の中で観察された組成物だけが遺伝子発現に影響を与えると予測される。 P値はTS細胞特異遺伝子およびES細胞特異遺伝子間の遺伝子型分布のフィッシャーの正確確率検定を用いて計算されている。 REP1およびREP2は、2つの反復実験を表す。（E）代表的なサイトカインおよび高頻度で胎児線維芽細胞に発現る細胞外マトリックス遺伝子のヒートマップ。全サンプルの中央値に対する万単位読み取り断片あたりの千単位エクソン断片の正規ログ比（FPKM）が示されている。
75：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 09:36:15: 驚くべきことにF1 129SV（129）とB6の細胞集団由来と注釈されているFI幹細胞はバイアスのないノンインプリンティング遺伝子の対立遺伝子分布パターンを示さなかった（サポート情報の図S1）。分布は不均等な染色体を有する細胞のものにより類似している。これらのFI肝細胞はFGF4<線維芽細胞増殖因子-4 >によったSTAP細胞から誘導され、かつそれらの遺伝子発現の特徴と胎盤に貢献する能力のように、栄養膜細胞（TS細胞）に似た特性を有することが報告されている(Obokata et al. 2014a)。
76：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 09:36:45: 大多数のSNPがB6と似ているという事実と組み合わせると、129B6F1遺伝子型とFI幹細胞曲線の明らかな差異はFI幹細胞がほぼ純粋なB6バックグラウンドの新生仔マウスに由来することを示唆している。遺伝子発現パターンの更なる分析は、B6型対立遺伝子と非B6間のSNPの不均一性が遺伝子発現特性に起因することが示唆されている。図2Bに示めされているように、129（すなわち、非B6）およびB6間で異質であることが期待されているSNPは、いくつかのES細胞マーカー遺伝子の中で調べられている。ES細胞はこの遺伝子座において129とB6の両方のバックグラウンドからの対立遺伝子を持ち込んでいるが、FI幹細胞は、ES細胞と同じ遺伝子背景を持つと書かれているにもかかわらず(Obokata et al. 2014a)、B6からの対立遺伝子しか持ち込んでいない。 B6遺伝子のこの優勢はTS細胞のマーカー遺伝子には観察されなかった（図2C）。
77：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 09:37:17: FI幹細胞の特異性は図2B及びCに示す遺伝子に限定されなかった。すべての異質SNPが、ES細胞に特異的遺伝子のSNP、TS細胞に特異的遺伝子のSNP、および他の遺伝子のSNPの3つのグループに分類されているとき、FI幹細胞のみがこれらのグループに広くヘテロ接合のSNPを有していた（図2D）。試料中に含まれるセルのすべが同じ細胞の特徴を共有している場合、異なる遺伝子型を有する特定の遺伝子セットのこの現象は見られ得ないであろう。
78：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 09:37:57: FI幹細胞はいくつかのTS細胞マーカーで特定の遺伝子型を示したので、それらはのTS細胞で混入汚染されている可能性がある。しかしながら、 FI幹細胞がその遺伝子型が元の論文に記載されていないマウス胚性線維芽（MEF)フィーダー細胞とともに培養されていたとしたら、フィーダー細胞も混入汚染の他の原因でありうる。この研究にとって、MEF<マウス胚性線維芽細胞>のためのマーカー遺伝子の発現は調べられており、かつ、ES細胞とTS細胞のマーカー発現と比較されていて、その結果はFI幹細胞の中のこれらのMEF遺伝子の発現の欠如を示している（図2E）。従ってMEF<胚性線維芽細胞>の混入の可能性は無視でき、かつ、重複RNA-seqの実験で検出された対立遺伝子頻度の傾斜分布の最も可能性の高い説明は、FI幹細胞の集団が次の2つの細胞型に由来していることである：B6遺伝子背景を有するES様細胞と、B6と129以外のマウス株で、CD1と同様の遺伝子型を有するTS様細胞。
79：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 09:38:30: ***撤回された論文の再分析：染色体異常の検出

SNPの分布分析は異数性を検出するためにも適用することができる。各染色体についての対立遺伝子頻度を調べる際には、対の染色体が同数の複写をもたないときに、異常な染色体が歪んだ分布を持つのだと推定される。図3Aに示すように、染色体分析は最初の研究で使われたSTAP細胞における8番染色体の異常を示している。細胞が異なる株の親からの2つの染色体を持っている場合には、我々はピーク対立遺伝子頻度が約50％に起こることを期待することができ.る。 STAP細胞のピークの対立遺伝子頻度は、しかし、約33％であった。それは2つの染色体の一つが染色体8の3つのコピーをもたらすように複製されたように見える。
80：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 09:39:02: 実験で使用されたSTAP細胞は129とB6細胞由来である。重複染色体は129の親からのものであると推定される。なぜならそれが唯一の非B6のSNP対立遺伝子を含んでいたためである。トリソミー8がマウスES細胞の中での最も一般的な染色体異常であることは注目に値する。それは97回の細胞株を調べたうちの31回この異常をもつと報告されていることである（Maysharら、2010）。トリソミー8を持つES細胞は生育が優性であるが、キメラは生殖系列への変異を引き起こさず(Ben-David et al. 2013)、マウス内のトリソミー8は12日目または13日目での出生前死亡をもたらします (Kim et al. 2013)。
81：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 09:39:43: 図3(省略)

原論文で確認して。
82：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 09:40:16: [図3] RNA-seqデータのSNP解析によって検出されたトリソミー。（A）全染色体と8番染色体の対立遺伝子頻度分布。STAP細胞の8番染色体のみが約50％を中心としないピークを持っていた。それは129株起源の8番染色体が染色体のトリソミー生成するように複製されたことを示す。図1及び図2で分析されたRNA-seqデータとは異なり、この図において分析されているRNA-seqデータはSMARTer試薬キットを使用して作られている。（B）染色体ごとの発現解析。 8番染色体上の遺伝子のみが有意に多く発現しし、13番染色体上の遺伝子が有意に低い発現している。 P値は二群スチューデントt検定を用いて計算されている。
83：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 09:40:47: メッセンジャーRNA解析を用いた異数性検出が報告されているので(Gropp 1982; Liu et al. 1997)、各染色体上の遺伝子発現を本研究で分析した。 8番染色体と13番染色体上の遺伝子はSTAP細胞とES細胞の間で有意に異なった発現パターンを持っていた。第8染色体遺伝子発現はES細胞よりSTAP細胞において1.3倍高かった(P-value = 2.89 × 10－25; 図3B)。この結果はSNP解析によって検出された8番染色体のトリソミーと一致している。ここで使用されているSNP対立遺伝子頻度法は、したがって、我々が細胞のSNPの遺伝子型を知っていて、かつ、対照細胞が正常な核型を持っている場合には異数性を検出するために使える。
84：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 10:57:55: ***SNP対立遺伝子頻度の有効性

SNP対立遺伝子頻度手法はRNA-seqデータを作成しようとするときに通常使用されるサンプル中の汚染細胞を検出するが、この手法の感度は配列リードの長さに依存する。ここで限られた数のRNA-seqデータセットを仮定すると、利用可能なSNPの数がおよそ千よりも少ない場合は、グラフは分配の違いを検出するにはあまりに雑音が多くなる。例えば、5948個のSNPを持つMEF＜マウス胎児線維芽細胞>は23838個のSNPを持つES細胞のデータよりもスパイクのより顕著な量を生成する。各染色体に割り当てられたSNPはまた、SNPの数が1000より小さいときの分布が非常にノイズが多くなりがちなことを示唆している（サポート情報の図S2）。二項分布の分散は試行回数に依存しているため、感度にとってはカバー率も重要である。それ故、平均カバー率がすべての遺伝子の20倍であることが要求されている場合、必要な読み出し回数は、MEF＜マウス胎児線維芽細胞>の分布を導出するために使用された約1.1×109塩基のリード回数にほぼ対応するところの、約1.3×109ヌクレオチドであろう（図1B）。
85：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 10:58:29: 図1Bはまた人工多能性幹細胞（iPS）のゲノム安定性のいくつかの興味深い側面を示している。 129B6F1から生成されたiPS細胞はB6型対立遺伝子のよりホモ接合したSNPを有していた。先に述べたように、これは細胞の汚染の結果であるかもしれないし、この二つの実験で使用された細胞の性質の違いの結果である可能性もあるが、実験プロセスが遺伝子型の転移を誘導したという魅力的な可能性もある。 iPS細胞工学がゲノム的な、および/または、ゲノム外環境的な不安定性を誘導すると報告されているように (Hussein et al. 2011; Chang et al. 2014)、今後の研究においてiPS細胞の対立遺伝子頻度を調べることが重要となるでしょう。
86：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 10:59:01: RNA-seqや他のNGS実験で検出されたSNP頻度の違いは、おそらく核型を直接観察することによって検出されるものと比べると、正確ではありません。しかし、この研究で記載された方法は、試験細胞がもはや利用不可能である場合でも、遺伝子型か表現型のみによるよりもより信頼できる証拠を提供することが期待されている遺伝子型（SNP）と表現型（遺伝子発現）の両者から染色体異常を検出するために使用することができます。
87：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 10:59:50: この研究のSNP対立遺伝子頻度法の1つの利点は染色体複製の親の起源を検出しかつ決定する、その潜在能力にある。仮想染色体分析(Ben-David et al. 2013)を介したもうひとつの利点は、異数性のない対照細胞を必要としないことである。なぜなら、シミュレートされたモデルはそもそも二倍体細胞の対立遺伝子頻度がピークを約50％に持っているだろうと期待しているからである（図1A）。
88：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 11:00:25: ***FI幹細胞サンプルの汚染

RNA-seq断片の対立遺伝子頻度の検討はサンプリングされた細胞の特性検出を可能にする。特定の細胞型において特殊に発現される一組の遺伝子が異なる遺伝子型を示す場合、その細胞の起源を想定することができる。メッセンジャーRNA配列におけるSNPに関するこの分析は、提示された小保方らの研究から、STAPとFI幹細胞サンプルの起源が最初に報告されたよりも異なっているらしいことを読み取る。シミュレーションは分布の様態がサンプルの細胞組成とPCRバイアスに起因する分散の両方に依存することを示している。二項分布のPCRバイアスを無視すると、我々は混入細胞の割合を大雑把に分布のピーク位置によって推定することができる。
89：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 11:01:01: 最初の研究でFI肝細胞を汚染する最も可能性の高い細胞型であるTS細胞は、非B6同型接合対立遺伝子よりももっと多くのヘテロ接合（B6/非B6）対立遺伝子を有していた。 FI幹細胞のSNPは、B6および129が異なるヌクレオチドを有し、かつそれぞれ、6859と7243のヘテロ接合SNPおよび24と14の非B6ホモ接合性対立遺伝子に結果された重複実験をされた対立遺伝子の中で数えられた。混入細胞の割合は遺伝子型観察によって推定することができる。なぜなら総数のピークが約10％であることが期待されているのに対して、ピークの対立遺伝子頻度が約95から96パーセントであったためである。この結果はTS細胞のマーカー遺伝子の発現と一致している。調べられたTS細胞のマーカー遺伝子の全てが約10％のTS細胞（図4A）の中で発現している。
90：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 11:02:17: 図4(省略)

原論文で確認して。
91：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 11:02:51: [図4] FI幹細胞に組み込まれたメッセンジャーRNAの検討。（A）ES細胞、TS細胞及びFI幹細胞の中のTS細胞マーカー遺伝子の発現。実線は平均のTS細胞遺伝子発現を示し、破線は平均の10％を示している。（B）B6と129が同じSNPを共有し、TS細胞はそうでない場合にDes、Grb2、Setd7、Fbxo21、およびChd4で検出されたヘテロ接合SNP。（C）TS細胞独自の対立遺伝子を有するヘテロ接合/ホモ接合のSNP分布のジーンワイズ分析。
92：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/27(木) 11:03:28: B6と129由来の配列が同じヌクレオチドを持ち、かつFI幹細胞由来のものはそうでない場合のFI幹細胞独自のSNPが検討された。これらのSNPの大部分は実験で使われたTS細胞のCD1バックグラウンドと一致し、かつB6または129とは異なっていた、対応遺伝子ごとの表示（図4B）及び全SNP分析（図4C）はFI幹細胞がTS細胞独自のSNPを共有していることを示している。FI幹細胞の中に混入したTS細胞の割合が軽微だったので、TS細胞独自のSNPのほとんどがヘテロ接合として現れた。これらの結果は、RNA-seqデータが、ES細胞のような発現パターンを持つ約90％のB6細胞と、TS細胞のようなパターンを有する約10％のCD1のような細胞の、二つの主要な細胞集団からの転写物を含んでいるという見解を支持する。したがって、FI幹細胞が胎盤に貢献するという小保方ら論文の主張は臓器幹細胞であることが知られている(Tanaka et al. 1998)TS細胞の混入による間違いを根拠にしているかも知れない。
93：名無しさん：2014/11/27(木) 11:04:07: ***STAP現象の解釈

SNPを使った異数性検出はまた元の実験に汚染のあることを示唆している。遺伝子型と表現型の両方の解析はObokataらの実験で使用されたSTAP細胞が8番染色体にトリソミーを有することを暗示し、転写因子検査は13番染色体上に遺伝子の異型の発現があることを示している。トリソミー8はマウスにおいて最も一般的な染色体異常であり、第8番染色体は13番染色体の末端に融合することが報告されている (Kim et al. 2013)。これらの観察は図3（b）の仮想染色体分析の結果を説明しているかもしれない。図3で使用されたRNA-seqデータは、STAP細胞が増殖しなかった条件下で培養された、新生児マウス脾臓細胞に由来するとして注釈されている。純粋なトリソミー8を有するマウスは胎生致死であるため、この記述は、トリソミーを有する細胞の優位性とは一致しない。したがって、これは、細胞がES細胞のものと非常に類似した発現特性を保有する培養細胞であったという結論に導く。
94：名無しさん：2014/11/27(木) 11:04:40: <結論>

ここで記述されたSNP対立遺伝子頻度法は汚染検査されている細胞が共通の遺伝的背景を共有している際には、対立遺伝子頻度が汚染を検出するのに十分なだけ異ならないかもしれないという事実によって制約されている。しかし、この方法は、原理的には、多型を含むどのRNA-seqのデータにも適用可能であり、また前向きであれ遡及的であれ両方の品質管理のために、特にES細胞やiPS細胞及びそれらの派生細胞などの培養細胞を用いた研究にとって、有用であろう。
95：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:38:55: <実験手順>

***データセット

マウスバリエーションデータはサンガーマウスゲノムプロジェクト (エイチティーティーピー略sanger.ac.uk/resources/mouse/genomes/)から入手された。またバージョン137 VCF-フォーマットデータセットはdbSNP (エイチティーティーピー略ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)から検索された。
96：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:39:43: 遺伝子および含まれているエキソンの位置はiGenomes（エイチティーティーピー略illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn）から入手された。エキソンの外側にあるSNPはこのiGenomesの注釈を使用して元のVCFファイルから除外されている。従って1016227のSNPはデータセット全体のために使用されている。
97：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:40:17: この研究で調べたオリジナルのRNA-seqの実験からの生配列データはNCBIのシーケンス・リード·アーカイブ（SRA）からダウンロードされている。プロジェクトの受託番号はSRP038104である。B6マウス株から得られたマウスのゲノム配列 (version 38, mm10) はNCBI GenBankからダウンロードされ、（着色スペースFASTQファイル用に）ボウタイで造られ、または（FASTQファイル用に）bowtie2で作られたプログラムを使用してボウタイデータベースにエンコードされた。RNA-seq実験のアクセッション番号（すなわち、SRA ID）は表S1（サポート情報）に表示され、かつアーカイブシーケンスのデータ送付の漏れが無いかのチェックサムは論文の責任著者の一人である山梨大学の若山照彦教授に確認してもらっている。
98：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:42:15: ***RNA-seq分析

SRAデータベースsra-形式ファイルはsratoolkit.2.3.4-2を使ってfastq形式に変換されている。配列アライメントのためにBowtie2（バージョン2.1.0、エイチティーティーピー略bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）とtophat2（エイチティーティーピー略tophat.cbcb.umd.edu）プログラムが適用されている。この研究はメッセンジャーRNAの構造を考慮していなかったので、すべての配列は、50 bpの読み取り断片に断片化され、2つのミスマッチを許容する “–no-coverage-search -G genes.gtf”パラメータを指定してトップハットまたはtophat2を使用して整列させた。トップハットプログラムは SOLiD colored space fastq filesを分析するためだけに使用された。遺伝子発現のレベルは、（バージョン2.1.1）のcufflinksを用いて算出されたfragments per kilobase of exon per million reads (FPKM) 値で評価されている。 C ++で書かれたプログラムはBAMファイルの中のSNP対立遺伝子を検出、列挙するために開発されています。プログラムは、公開リポジトリ（エイチティーティーピー略github.com/takaho/snpexp/）で入手可能なオープンソースソフトウェアです。百万カフスを値を読み込むごと
99：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:42:48: ***SNPの識別およびヘテロ接合性のテスト

マウスゲノム上に整列した配列断片は、SNP検出および上記の計数プログラムを使って分析されている。かつ20以上のカバー率のSNPだけが残されている。 95％以上のSNPシーケンスが二本鎖上で同じだった場合、対立遺伝子はホモ接合と定義される。
100：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:43:21: B6と129との間の全ゲノムのヘテロ接合は、B6と129 との異なる対立遺伝子による上述したSNPサブセットを使用して分析されている。SNPは既知の発現特性（TS細胞特異的、ES細胞特異的、またはその他）と遺伝子型（B6型ホモ接合、129型ホモ接合またはその他）によって分類されている。SNP分布は、モンテカルロマルコフ連鎖近似に関するフィッシャーの確率検証を用いて得られたP値によって調べられている。
101：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:43:54: ***トリソミー識別のための染色体による発現解析

ES細胞（SRR1171574とSRR1171575）及びSTAP細胞（SRR1171578とSRR1171579）由来のFPKM値が算出され、全4回のオリジナルの実験における0.01以上のFPKMを有する遺伝子が選択された。染色体上に偽遺伝子を伴わない遺伝子を分類し、各染色体について同じ細胞を用いた2つの実験の平均の対数比を決定した。相対FPKM値の分布は、全体の遺伝子の平均log比に対して、一群t検定を用いて評価した。
102：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:44:33: ***MEFマーカー遺伝子

フィーダー細胞のマーカー遺伝子はジャファルシャリフ博士や磯野恭一博士によって提供されている未公開のRNA-seqデータを用いて同定されている。 ES細胞、TS細胞及びMEF（マウス胎児線維芽細胞)間の遺伝子発現の違いはcuffdiffプログラムを用いて比較されていて、MEFの中で有意に高頻度で発現された遺伝子が選択されている。サイトカインおよび細胞外マトリックス関連遺伝子をコードする遺伝子が図2Eのフィーダー細胞の特徴を説明するために選ばれている。
103：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 11:45:14: <謝辞>

私はまず慶應義塾大学の吉村明彦博士に謝辞をささげたい。博士は最初にウェブサイト上でNGSデータがSNP解析により評価しうると示唆された方です。理化学研究所統合生命医科学研究センターの谷内一郎博士とNyambayar Dashtsoodol博士には実験手順を解釈するための洞察力に富んだ情報を提供していただきました。同じく理化学研究所統合生命医科学研究センターの早津徳人博士には遺伝子型解析を検証するために未発表の近親交配系/非近親交配系のマウスシーケンスを提供していただきました。同じく理化学研究所統合生命医科学研究センターのジャファルシャリフ博士と磯野恭一博士にはマーカー遺伝子を特定するために未発表のトランスクリプトームデータを提供していただきました。理研の中川真一博士には私の原稿に重要なコメントを提供していただきました。そして環境資源科学研究センター (CSRS)のデビッド·ギフォード氏はテキストを編集してくれました。また特に取下げ論文の著者である山梨大学の若山照彦博士と理研CDBの丹羽仁博士にはこの原稿について論評していただいたことに感謝致します。
104：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:00:54: <参照>

Ben-David, U., Mayshar, Y. & Benvenisty, N. (2013) 　『世界的遺伝子発現プロファイルに基づく多能性幹細胞の仮想核型分類』　Nat. Protoc. 8, 989–997
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106：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:02:03: DeVeale, B., van der Kooy, D. & Babak, T. (2012)　『RNA-配列によるインプリント遺伝子発現の重要な評価：新たな視点』PLoS Genet. 8, e1002600
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107：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:02:38: Gropp, A. (1982) 　『トリソミーのための動物モデル』 Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histol. 395, 117–131
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Abstract
PDF(121K)
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117：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:08:17: <サポート情報>

(ファイル名) gtc12178-sup-0001-FigS1.pdf
(書式) application/PDF
(サイズ) 265K
（説明）　図S1　小保方らの研究の中で報告された細胞株に対して得られたRNA-seqデータからの対立遺伝子分布。 CD45+細胞（灰色）、ES細胞（黄）、STAP細胞（青）、STAP幹細胞（緑）、TS細胞（オレンジ）、EpiSCs<エピプラスト幹細胞>（水色）、およびFI幹細胞の（赤）。 ES細胞、STAP細胞、STAP幹細胞、FI幹細胞、および胚盤葉上層幹細胞（EpiSCs）は129B6F1株由来のものとして、またTS細胞はCD1株由来のものとして注釈されている。
118：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:08:52: (ファイル名) gtc12178-sup-0002-FigS2.pdf
(書式) application/PDF
(サイズ) 214K
（説明）　図S2　すべての染色体の対立遺伝子頻度。すべての常染色体とX染色体上のSNPが計数され、かつそれらの分布が示されている。 CD45+およびSTAP細胞からのRNA-seqデータは図3で使用されているものと同一である。各染色体名の後の数字はそれぞれ、CD45+ rep1、CD45+ rep2、STAP rep1、及びSTAP　rep2のSNPの数である。
119：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:11:04: (ファイル名) 省略
(書式) 省略
(サイズ) 11K
（説明）表S1 本研究で用いたRNA-seqの生データ
120：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:11:47: ご注意：ワイリーブラックウェルは、著者によって提供されるあらゆる補助情報の内容や機能についての責任を負いません。（コンテンツの欠落を除く）ご質問は記事の責任著者の方へお願いします。
121：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:12:49: 以上。
122：名無しさん：2014/11/28(金) 16:13:24: 結局、どういうことが書いてあるの?
123：セント・パンテレイモン。ふふふ三世：2014/11/28(金) 16:14:16: 分からん。
124：ウィキ物知りさん：2014/11/28(金) 18:42:42: 人類は全員９９．９％同じDNAの塩基配列を持ってて、これがもっと
違ってたら種が異なるということになるんでしょ。１０００分の１の
範囲内の違いが各人の個性だね。黒人と白人の違いも所詮メラニン色素の
量だけで、文化人類学的な類型認識と違って、肌の色なんて生物学的分類の
概念では一つの個性に過ぎない。もっとすごい違いも知られていて、
ある地域の人々には放射能に強いタイプがあって、こんなのは外から見たって
区別はつかないけど、肌の色と違ってすさまじい個性の違いよね。
125：名無しさん：2014/11/28(金) 18:43:22: 遠藤博士の言ってるスニップって何なのよ？
126：ウィキ物知りさん：2014/11/28(金) 18:44:43: 人類の違いって所詮ＤＮＡ配列の１０００分の1の中で起きるたんぱく質
合成の違いでしょ。でも更に狭い集団を取って、その中でＤＮＡ配列の何かが
違っている個体が1％、つまり１００人に１人あるときにそれを多型って
言うのよ。それが４種類の塩基の一つが原因で起きている多型を
一塩基性多型、スニップと呼ぶ。それよりも少ない違いは変異とか変化と
呼ぶ。
127：名無しさん：2014/11/28(金) 18:45:32: ふーーーん。
128：名無しさん：2014/11/29(土) 07:20:51: 発表があったな。
129：名無しさん：2014/11/29(土) 07:25:24: ああ、そうだね。
小保方の検証実験の「進め方」によれば
Ｏｃｔ4-ＧＦＰ陽性細胞の出現が確認されなかった場合の自動的打ち切りか、
検証事項が全部終わっちまった場合の改革推進本部への報告を経ての
継続の要否判断によるものかのいずれかでしょうね。
130：名無しさん：2014/11/29(土) 07:31:29: 何も出来なかったということはないだろうね。というのも結果発表の日時を
特定できない理由として実験データの解釈に時間が掛かるかもしれないという
理研側の説明があったらしいことを朝日を除く各紙が伝えている。
131：名無しさん：2014/11/29(土) 07:36:27: この場合は弱Ｏｃｔ4-ＧＦＰ陽性ということになって近大とおなじ結果と
推定されるけど、ただし「進め方」の趣旨には反しているね。この場合は
３月までは続けるはずなんだな。丹羽の実験は続いていくので、小保方が
何かの勘違いを納得したというのでなければ通常は継続されるはずだね。
特に、この本人による検証は疑惑がかかったときの本人の抗弁の権利でも
あるんだよね。
132：名無しさん：2014/11/29(土) 07:37:31: じゃあ、出来てる想定だとどんな解釈？
133：名無しさん：2014/11/29(土) 07:38:55: 検証項目は以下の５つでしょ。途中でやめるなら全部終わってるということになる。

①マウス組織からのＯｃｔ4-ＧＦＰ陽性細胞の出現
②Ｏｃｔ4-ＧＦＰ陽性細胞のキメラ形成能、テラトーマ形成能
③ＳＴＡＰ細胞からの、スタップ幹細胞の形成能
④ＳＴＡＰ幹細胞のキメラ形成能、テラトーマ形成能
⑤ＳＴＡＰ細胞、ＳＴＡＰ幹細胞が最終分化細胞から形成されるかどうかの検証
134：名無しさん：2014/11/29(土) 07:40:32: 小保方さんはほぼ９月から１１月の３ヶ月間実験しているので、
２０１１年１１月のキメラ成功までほぼ１ヶ月間しか掛からなかったことを
考えて、同時並行でやれる過程を考慮すると⑤のＴＳＲ再構成の確認に
２ヶ月程度かかったと思えば、確かにそんなに不思議でない日程だね。
この後は、このプロトコルに従って理研内での追試を行い、
来年度から内外の研究機関に検証をお願いするということになってるね。
135：名無しさん：2014/11/29(土) 07:42:04: どっちだろうね？
136：名無しさん：2014/11/29(土) 07:43:51: それは分からないよ。どっちの可能性もあるだろうけど
われわれは小保方擁護なんだから、後者であってほしいと
願うだけさ。
相沢の指導の下でデータを取りまとめるといってるところをどう解釈するかな？
137：名無しさん：2014/11/29(土) 07:44:57: 相沢は新しい組織の元で小保方の上司になってるからでしょ。
138：名無しさん：2014/11/29(土) 07:46:59: 無論そうなんだけどね。でも全部出来て終わっちまったとしたら
誰がキメラを作ったのかという疑問が生じるでしょ。
この場合、相沢しかいないでしょ。
139：名無しさん：2014/11/29(土) 07:48:01: そうだね、取り下げられた論文ってどうなるんだろうね？
140：名無しさん：2014/11/29(土) 07:50:30: 取り下げられたというのはもうその論文はないのよ。
だから学説発表としては新たに書かないといけないけど、別に以前の
論文をリバイズして別の雑誌にでも掲載すればいいんで、特許はもう
手続き進行中だから今回は無関係だ。
141：名無しさん：2014/11/29(土) 07:51:47: ｏｃｔ4段階でダメならもっと早く打ち切るべきでギリギリまでやる必要の意味がわからん。
改革委員会でも小保方は論文で示した通りの実験しか出来いはず。
142：名無しさん：2014/11/29(土) 07:52:14: でも、写真は全部今回の新しい実験のときのデータに差し替えられてしまうんだね。
若山ｘｙの撮った写真は外されてしまう。
論文の著者にも入らないということ？
143：名無しさん：2014/11/29(土) 07:56:41: そういう問題が又いろいろと出てくるだろうから
いまから調整しないといけないだろうね。
ただ、成功していたら若山さんにもかかっていた嫌疑も消えるわけだから
全体としては言い話で決着することになる。
今、理研の竹市さんの研究室のホームページで笹井さんの追悼企画を
掲載してるでしょ。なんとなく流れは感じてたんだけどね。
144：名無しさん：2014/11/29(土) 07:59:09: まだわからないね。
推測に過ぎない。
いずれにせよ、この遠藤論文の検討は続けないといけないね。
どっちに転んでもこれが問題になる。
145：名無しさん：2014/11/30(日) 04:38:13: 一応、データとして残しておきましょう。

ＳＴＡＰ細胞:理研、小保方氏の実験３０日に終了
毎日新聞　2014年11月28日　23時02分（最終更新　11月29日　09時54分）
理化学研究所は２８日、ＳＴＡＰ細胞の有無を調べる検証実験のうち、
小保方晴子氏による実験を当初の予定通り３０日で終えると明らかにした。
実験の結果はデータがまとまり次第公表する方針。しかし実験データの
解釈に時間を要する可能性があり、公表時期は未定としている。
小保方氏は実験の終了後、検証チームを率いる相沢慎一氏らの指導を
受けながら、得られたデータの整理や解析を担う。
検証チームは８月、小保方氏らが発表した論文に記載された手法では、
ＳＴＡＰ細胞は再現できていないとする中間報告を発表。当初から進捗
（しんちょく）状況にかかわらず１１月末で小保方氏の実験を打ち切ると
していた。（共同）
146：名無しさん：2014/11/30(日) 04:39:25: 相沢氏の指導を受けながら得られたデータの整理や解析を行なうというのは
意味深ですね。
弱オクト4発現の解釈ではありませんね。
もしそうなら、今まで強発現していた細胞は何であったのか、若山氏に
渡してキメラ成功した細胞は何だったのかが直ちに問題にならなければ
なりませんから、意味の無い実験のデータの解釈なんかしている場合では
ありませんね。その場合はデータを整理する必要すらありません。

全部出来てしまったと考えるのが一番自然です。
その中に解釈を要するものがあるということです。
147：名無しさん：2014/11/30(日) 04:39:55: できてたとしたら黒田論文はこれから検証されなければなりませんね。
でも、その前に、小保方さんはどんな実験をしていたのでしょうかね。
もう一度丹羽さんのプロトコルに戻って想像してみましょうか。
セント・パンテレイモン・ふふふ三世さん、お願いします。
148：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:40:32: ええっ、又かい。でもどうせまだ時間が掛かるみたいだから
暇つぶしにいいかな。
149：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:41:18: 体細胞からのSTAP細胞変換培養に欠かせない技術上の秘訣
Haruko Obokata,
Yoshiki Sasai
& Hitoshi Niwa
STAP Group RIKEN CDB
Journal name:
Protocol Exchange
Year published:
-2014
DOI:
doi:10.1038/protex.2014.008
Published online
5-Mar-14
150：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:41:52: 要約
手順
参照
関連著作物
著者紹介

本論文が取り下げられていますので、作者らはこのプロトコルイクスチェンジのプロトコルを取り下げています。
151：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:42:27: ＜要約＞
刺激惹起性多能性獲得（STAP）は最近2つの論文で報告された細胞の再プログラミング現象である (Obokata, Nature, 2014a,b)。この再プログラミングプロセスでは、強力な外部刺激に応じて、新生児の体細胞が、Oct3/4のような多能性関連遺伝子を発現し、体外体内および体内で、三胚葉すべての派生物に分化する能力を獲得した細胞に変換される。、STAP細胞と定義されたこれらの細胞は胚盤胞注入後にキメラ胎児に寄与することができる。それにとどまらず、胚盤胞注入試験において、注入されSTAP細胞はまた胎盤などの胚の外部組織においても見出される。
152：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:43:01: 新生児の体細胞に由来するSTAP細胞はこのように多能性状態に完全に再プログラムされている。 STAP細胞の樹立のための条件下では、それらの増殖能力は、胚性幹細胞（ESCｓ）のものとは異なり、非常に制限されている。 STAP細胞はさらに二つのタイプ増殖性細胞株に変換することができる。STAP幹細胞およびFGF4誘発性幹細胞（FI幹細胞）である。ACTH含有培地の中で（手順参照）、STAP細胞から変換されたSTAP幹細胞は、胚の外部組織に貢献する能力を失う。FGF4含有培地中の中でSTAP細胞から生成されたFI幹細胞は、それらの胚への寄与は比較的低いが、胚盤胞注入検査で、胚および胚の外部系統の両方に貢献する能力を保持する。
153：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:43:36: 外部刺激によって誘導されるSTAP現象は潜在的に哺乳動物細胞における多能性および分化に関する我々の理解に新たな光を投げかけるものである。この予期しない現象は例えば低pH溶液に過渡の曝すことによって新生児の造血細胞で惹起されうるものである。その見かけの単純さにかかわらず、この手順では細胞の取り扱いや培養条件のみならず、最初の細胞集団の選択にも特別な注意が必要である。細胞に最適レベルの亜致死刺激を与えることがSTAP細胞誘導の過程に不可欠である。我々の経験では、STAP変換はほとんどの細胞が低pH処理後一日生存し、その後初期細胞数の80％までが2から3日位で死亡するような培養条件で再現的に見られる。溶液のpHの調整だけが重要な要因ではなく、亜致死ストレスの遅発性も非常に重要である。
154：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:44:12: この生物学的状況はまた他の多くの要因によっても影響され得る。例えばストレスにさらす前後の体細胞の準備と取り扱いは、過剰な細胞死か、不十分な惹起性が引き起こされた場合に、細胞への追加ダメージがストレスレベルを変更することができるように、注意深く行なわれなければならない。STAP変換に使用される細胞のタイプも重要であり、他のソースからの細胞の使用（例えば、継代後の培養線維芽細胞の使用）もSTAP変換を達成するために障害をもたらし得る。適切な手順が正しい順序で行なわれている場合に我々はSTAP細胞の変換を再現的に観察している。
155：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/11/30(日) 04:45:01: この技術の広範なテストと使用を容易にするために我々は今、ステップバイステップ手順の完全なプロトコル論文を準備中です。しかしながら、完全な原稿の作成、提出、公表にはかなりの時間がかかるので、我々は、このProtocol ExchangeでSTAP細胞の変換培養（および関連の実験）のための多くの技術的な秘訣を共有したいと思います。我々はこれらの技術的な秘訣が実験の詳細についてしばしば問われる多くの質問に答えることになることを願っています。
156：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:26:32: ＜手順＞
***組織収集および低pH処理
1.　CD45陽性造血細胞を単離するために、1週齢のOct4-GFPマウス（特に指定のない限り）から脾臓が摘出され、ハサミによりミンチされ、そして機械的にパスツールピペットを用いて分離される。
[重要]
(i) 接着細胞は機械的または酵素的に（トリプシンまたはコラゲナーゼにより）単一細胞に解離されなければならない。図3ａ (Obokata et al. Nature, 2014a)で説明されている組織のうち、他の細胞が機械的に解離させられたのに対して、筋肉、脂肪組織および線維芽細胞は酵素的に解離させられている。
157：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:27:23: (ii)一次細胞が使用されるべきである。我々は新鮮なマウス胚線維芽細胞（MEF）なら可能であるが、体外で増殖されたMEFを再プログラムすることは困難であることをすでに知っている。
(iii) 報告されている実験のために、我々は、理化学研究所バイオリソースセンターによってGOF18-GFP株11トランスジェニックマウス(B6;B6D2-Tg(GOF18/EGFP)11/Rbrc)として維持されている、Oct-3/4-EGFPトランスジェニックマウス株を使っている(Ohbo et al, Dev Biol, 2003; Yoshimizu et al, Dev Growth Differ, 1999)。導入遺伝子のホモ接合体は、強化された信号を得るため、ライブイメージング用に使用されている。
(iv)1週間以上経過したマウス由来の細胞は現在のプロトコルの下では非常に貧弱な再プログラミング効率を示した。雄の動物からの細胞は雌からのものよりも高い効率を示している。
158：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:27:55: 2.　解離脾臓細胞をPBS＜リン酸緩衝生理食塩水　Phosphate buffered saline＞で懸濁し、細胞濾過器（BD Biosciences社352340）で漉した。
3.　1000回転/分で５分間遠心分離した後、回収した細胞をDMEM培地＜ダルベッコ変法イーグル培地　Dulbecco's modified Eagle medium＞に再懸濁し、同じ体積のヒトリンパ球分離性溶液＜lympholyt＞（セダレーン社）を添加し、次いで20分間1000ｇで遠心分離した。