遠藤高帆博士の論文 - 1412748401

161：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:29:42: 5.　細胞選別後、１００万個のCD45陽性細胞を37℃で25分間、低pH（塩酸によりpHを5.7に滴定）のHBSS＜ハンクス平衡塩溶液溶液＞500μlで処理し、次いで室温で1000rpmで5分間遠心分離した。
[重要]
（i）HBSSの緩衝作用が弱いため、溶液のキャリーオーバーがpHに影響する可能性がある。以下の方法に従ってpHを5.7に調整してください。まず、事前に4℃に冷却されたHBSS494μlに細胞ペレットを懸濁し、次に、5.7の最終pHに調整するために希釈塩酸（HBSS590μlに35％塩酸を10μl）を6μl追加する。パイロット実験で最終pHを確認し、加える塩酸の量を必要に応じて最適化してください。そうでなければ、事前に4℃に冷却されたHBSS-pH5.4に細胞ペレットを懸濁してください。
162：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:30:18: (ii)我々の使用したHBSSはCa2+/Mg2+ free（ギブコ社14170-112）である。
(iii)炭酸ガス培養器内でHBSSに懸濁した細胞を培養してください。
（iv）細胞生存率はこの行程における重要なパラメータである。図1dに示すように、最適な条件下で、大量の細胞死がプレーティング後2日目に観察される (Obokata et al. Nature, 2014a)。
(v)プレーティング後一日目で大量の細胞死があった場合は、低pHのHBSS溶液での培養期間を15分に短縮することによって改善することができる。
163：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:30:51: 6.　上澄み（低pH溶液）を除去した後、沈殿細胞を再懸濁し、千U LIF（シグマ社）と2％のB27（インビトロジェン社）を入れたDMEM / F12培地の中の非接着性培養プレートに播種する（通常、１０万個細胞/ ml）。
[重要]
(i)非接着性培養プレートの使用が推奨される。なぜなら、細胞クラスターの形成は再プログラミングのための重要なステップであるが、接着性表面は、クラスタを形成するのに必要な細胞の移動を阻害しうるからである。
164：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:31:26: （ii）細胞密度は重要であり、それは細胞生存率に依存している。密度は培養表面1平方センチメートルあたり１０万から１００万個の細胞で維持されるべきである。
(iii)B27（インビトロジェン社17504-044）は商品バッチ間で違いのあることがある。 ES細胞のN2B27-2iLIF培養によって品質を確認してください。
7.　細胞のクラスター形成はOct3/4-GFP陽性細胞のパーセンテージに対してよりも、プレート移植されている細胞密度に対してより敏感であった。生存細胞数はドナーマウスの年齢に敏感であり、成長したマウス脾臓を用いた場合、上述した処理条件下で低かった。
165：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:31:58: [重要]
(i)ドナーマウスは1週齢もしくはもっと若くあるべきである。高齢の動物からの細胞を用いると再プログラミング効率は劇的に落ちる。
（ii）STAP細胞は複数の細胞のクラスタから誘導される。それらは単一種細胞ではない。
166：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:32:32: ８.　2から7日目のにおけるのLIFの添加は、拡張データ図1ｆに示すように、7日目のOct3/4-GFP陽性STAP細胞クラスターを生成するために不可欠であった(Obokata et al. Nature, 2014a)。LIFの存在しない場合でも、Oct3/4-GFP陽性細胞（ほとんどが薄暗いシグナルを示したが）は培養2から5日の間に、低pH値で処理したCD45陽性細胞の中に一過的に現れたが、その後に姿を消した。LIF依存の次の段階に対してＬＩＦ非依存の初期段階のあることを示唆している。
167：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/01(月) 10:33:02: [重要]
(i)再プログラミングの後期段階ではLIFは不可欠ですので、再プログラミング事象は遺伝的背景に依存しているのかも知れない。我々は主に129、C57BL6、またはそれらのF1株を使用したが、これらの遺伝的背景のすべてがLIFへの高い応答性に関連しているからである。
(ii) GFPシグナルは、同じレポーターを持っているES細胞のそれより弱いが、それは図1ｇに見られるように、STAP細胞の体積がES細胞よりも小さいためである(Obokata et al. Nature, 2014a)。
168：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:23:12: ***STAP幹細胞変換培養
1. STAP幹細胞株を確立するために、 STAP細胞クラスターはMEFフィーダー細胞上のACTH含有培地に移される。（96ウェルプレートの1ウェルあたり１ダースまでの複数のクラスタ）
169：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:23:46: [重要]
(i)ACTH（1-24）は、アメリカンペプチド社および他の会社から入手可能である。我々は委託契約でクラボウによって合成されたACTHを使用していた。この培地の組成は、GMEM、15％ノックアウト血清代替TM（KSR、Invitrogen社）、1×非必須アミノ酸（NEAA）、1×ピルビン酸ナトリウム、10 -4 M2-メルカプトエタノール、1000U / mlのLIF、および10μM　ACTHである　(Ogawa et al, Genes Cells, 2004)。 STAP細胞のクラスターは図4a (Obokata et al. Nature, 2014a)にしめされた胚盤胞注入の場合のように単離され小片に切開され、ACTH培地中のマウス胚線維芽細胞フィーダー細胞上に播種された。
(ii)ACTH含有培地はステムミージャムアドレスのDSファーマバイオメディカル社（大阪、日本）から購入されている。
170：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:24:19: 2.　培養の2から7日後に、細胞は従来のトリプシン法を使って第一段階に供され、懸濁した細胞を、20％FBS＜ウシ胎児血清　fetal bovine serum＞を含むES細胞維持培地に蒔種された。
[重要]
（i）ES細胞維持培地は KnockoutTM DMEM＜イーグル最小必須培地＞（Life Technologies社）、20％FBS、1×NEAA、1×グルタミン、1×ヌクレオシド、10 -4M　2-メルカプトエタノール及び1000 U/mlのLIFから構成されている。
（ii）のFBSロットは、マウスES細胞の培養に使用するための適合性が確認されるべきである。
171：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:24:52: （鄴）我々はCD45陽性造血細胞に由来するSTAP細胞から複数のSTAP幹細胞株を確立している。調べた8個のクローンのうちのいずれも再構成されたTCR対立遺伝子を含んでいなかった。このことはSTAP細胞が変換プロセスでSTAP幹細胞になるための、（もとの細胞の突然変異含む）陰性の細胞型依存バイアスの可能性を示唆している。これは現在のプロトコルにおいて、非新生細胞をもとの体細胞として使用したときに、STAP細胞の変換がそれほど効率的でなかったという事実に関係しているかも知れない。
172：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:25:27: 3.　その後の継代はサブコンフルエント（シャーレ一杯になる前）に達するまでの二日置きに、1対10の分割比で行なった。我々はSTAP細胞クラスターからSTAP幹細胞を樹立するために、マウスの以下の3つの異なる遺伝的背景をテストし、再現性の確立を観察した。Oct4-GFP（29の29）を持つC57BL/6、Rosa26-GFP（2の2）をもつ129/ SV、および129/ CAG-GFP（16の12）をもつSV×C57BL/6。すべてのこれらの遺伝的背景を持つSTAP幹細胞はキメラ形成活性を示した。
173：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:25:59: ***FI幹細胞変換培養
1. STAP細胞クラスターがFGF4を含む96ウェルプレート中のMEFフィーダー細胞上のＴＳ細胞＜栄養芽層幹細胞＞培地 (Tanaka et al, Science, 1998)に移される (Obokata, Nature, 2014b)。
[重要]
（i）TS培地は20％のFBS＜ウシ胎児血清＞を含むRPMI1640＜ロズウェルパーク記念研究所培地　Roswell Park Memorial Institute medium＞、1mMのピルビン酸ナトリウム、100μMの2-メルカプトエタノール、2mMのL-グルタミン、組換えFGF4の25 ng / ml及びヘパリンの1μg/mlで構成されている。
(ii)FBSのロットの違いは培養細胞の挙動に重大な差異をもたらしうる。
174：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:26:38: 2.　ほとんどの場合（40から50回の実験）、コロニーは96ウェルプレートのウェルの10から50％までに成長した。少数の例（50のうちの１０回の実験）では、全くコロニー増殖が観察されずに、かつ/または、わずかの線維芽細胞様細胞が出現した。
重要
(i)増殖コロニー内の細胞はまた線維芽細胞のように現れるが、徐々に形態を変更して上皮細胞に似てくる。
175：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:27:14: 3.　細胞を従来のトリプシン法を用いて7-10日間の最初の継代に供した。それらがサブコンフルエントに達する前に３日おきに４対１の分割比でその後の継代を行った。
[重要]
(i) 細胞は完全に解離されてはいけない。胚由来のトロホブラスト幹細胞の場合に見られるように、部分的な解離が生存能力および自己再生を維持するのに最適である。
176：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:27:47: ＜参照＞
Obokata, H. et al.Obokata.　『体細胞の多能性への刺激惹起性運命変換』Nature, 505, 641-647 (2014a)
Obokata, H. et al.　『取得多能性を持つ再プログラム細胞における双方向への発生能力』 676–680 (2014b)
Ohbo, K. et al.　『マウスの小さな星の中に満たされた思春期前の精子形成における幹細胞の同定と特徴づけ』　Dev. Biol. 258, 209–225 (2003)
177：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:28:21: Yoshimizu, T. et al.　『マウスのOct4/緑色蛍光タンパク質（GFP）導入遺伝子の生殖細胞特異的発現』　Dev. Growth. Differ. 6, 675-684 (1999)
Ogawa, K., Matsui, H., Ohtsuka, S. & Niwa, H.　『マウスES細胞のクローン増殖を調節するための新しいメカニズム』　Genes Cells 9, 471–477 (2004)
Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. & Rossant, J.　『FGF4＜線維芽細胞増殖因子＞によるＴＳ細胞増殖の推進』　Science 282, 2072–2075 (1998)
178：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:28:55: ＜関連著作物＞
このプロトコルは下記論文に関連している。
『体細胞の多能性への刺激惹起性運命変換』
Haruko Obokata, Teruhiko Wakayama, Yoshiki Sasai, Koji Kojima, Martin P. Vacanti, Hitoshi Niwa, Masayuki Yamato, and Charles A. Vacanti
Journal title
Nature
Vol.
505
Issue
-7485
Pages
641 - 647
Publication date
29/01/2014
DOI:
doi:10.1038/nature12969
179：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:29:33: 『取得多能性を持つ再プログラム細胞における双方向への発生能力』
Haruko Obokata, Yoshiki Sasai, Hitoshi Niwa, Mitsutaka Kadota, Munazah Andrabi, Nozomu Takata, Mikiko Tokoro, Yukari Terashita, Shigenobu Yonemura, Charles A. Vacanti, and Teruhiko Wakayama
Journal title
Nature
Vol.
506
Issue
-7484
Pages
677 - 680
Publication date
29/01/2015
DOI:
doi:10.1038/nature12970
180：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:30:06: ＜著者紹介＞
［所属］
1.細胞リプログラミング研究室、理研CDB
小保方晴子
2.器官発生・神経発生研究室、理研CDB
笹井芳樹
多能性幹細胞解明研究室、理研CDB
丹羽仁
［金銭的利益相反］
著者等は金銭的利益相反のないことを宣誓します。
［責任著者］
連絡はこちらへ
丹羽仁（アドレス）
181：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:30:39: 以上
182：名無しさん：2014/12/02(火) 07:31:10: 何が書いてあったの？
183：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:32:18: よくわかんないけど小保方さんがＥＳ細胞を持っていた理由は分かった。
184：名無しさん：2014/12/02(火) 07:32:49: なんでなの？
185：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:34:41: 培地の有効性を試験するためもあるみたいだね。
購入した薬剤はロットによって微妙に違うんで
ＥＳで試験してみたりするらしいな。
186：名無しさん：2014/12/02(火) 07:35:55: 結局プロトコル読み直してみてどうなのよ。
どんな実験なの？
187：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:38:47: そんなに単純な手技じゃないということはこれだけでも分かるね。
でも疑う人が読めばヤッパリ疑えるんでどうにでも読み取るでしょうね。
188：名無しさん：2014/12/02(火) 07:40:35: 遠藤論文はどうするの？
素人では歯が立ちそうもないね。
189：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:43:04: ちょっと分野が専門的過ぎるのと論文の内容が具体的でないから
取っ掛かりが難しいな。何をやったか具体的に書かれていたら素人でも
何か入り口が見つかりそうなもんだけどな。
190：名無しさん：2014/12/02(火) 07:49:18: 小保方の提出した資料を分析部門が解析して提出登録していたデータを
遠藤さんが取り寄せて自分のパソコンで市販のアプリを使ってスニップの比較解析した
ものなんでしょう？
分析した生データの添付がないから、実際に何したか分からない上に
たぶんそんなもの付けられたって素人にはチンブンカンブンなんだろうな。
図だけ見たってそれこそいくらでも作れるからな。ただ、東大の友人が
おなじ解析してるというから幾分結果の一致には信頼性があるかな？
191：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/02(火) 07:50:51: さてさて、どうなることやら、まだ時間はありそうだから考えてみるかいな。
192：名無しさん：2014/12/06(土) 10:45:24: ふむふむ。
193：名無しさん：2014/12/06(土) 15:28:24: えっ。
194：名無しさん：2014/12/09(火) 05:27:28: そうねえ。
195：名無しさん：2014/12/11(木) 06:16:43: なに？
196：名無しさん：2014/12/12(金) 19:20:11: わかんない。
197：名無しさん：2014/12/15(月) 07:06:08: ん？
198：名無しさん：2014/12/16(火) 10:07:16: 何？
199：名無しさん：2014/12/21(日) 13:38:16: FI培地では、ESはボロボロになって全滅する。まいったか！
200：源氏蛍 ◆VnRg4xmClA：2014/12/21(日) 17:02:43: >>199
参りません。
論文作成時に、その部分の実験が適正に行われたという確たる証拠がありませんから。

登録データからはFI幹細胞はES＋TSが疑われるわけです。

STAP幹細胞は凍結保存されている実物がありましたが、FI幹細胞も保存されている分があったんでしたっけね？もし存在するのであれば調査委員会が残っている実物を解析すれば分かると思います。
201：名無しさん：2014/12/21(日) 21:21:27: >>200

　その時がたのしみだ。
202：名無しさん：2014/12/21(日) 22:26:25: キメラマウスの作成時には、FI幹細胞と呼ばれた細胞は、実験前に、シャーレごと
ES細胞へすり替えられた可能性があるように思う。
203：源氏蛍 ◆VnRg4xmClA：2014/12/21(日) 23:21:50: そうですね。
データ登録のときに出したのはES＋TSで、今保存されているFI幹細胞があるならば、正体は全てESだったり、全てTSだったり、株によってESの株とTSの株があったりするのかもしれませんね。
204：名無しさん：2014/12/22(月) 08:36:44: ＞＞203

//////
ーーーー
●　　　●　　２０１１年１１月、若山先生がキメラ成功させたときに
　　へ　　　　渡された細胞はＥＳでしたか？
205：名無しさん：2014/12/22(月) 08:54:09: >>202

そこは、W氏の担当だったね。
206：名無しさん：2014/12/22(月) 10:02:29: >>203
確かに、理研に保存されたFI幹細胞からは何が出てきてもおかしくないね。

＝＝＝

STAP幹細胞樹立時には、少量のES細胞をシャーレの中へ混入させ、そのまま、
育ってきたES細胞が、キメラ作成に使われた。

FI幹細胞樹立時には、少量のTS細胞をシャーレの中へ混入させ、TS細胞が育てられていた。
しかし、キメラ実験の前には、シャーレごと、ES細胞へのすり替えられて、そこから、キメラが作られた。

あるいは、FGF4入りのFI培地の入ったボトルが、すぐに、ボトルごと、ES細胞用の培地のボトルにすり替えられて、
若山氏は、FI幹細胞樹立時にも、混入させられたES細胞を増やしただけかもしれない。

＝＝＝

こうでも考えないと、FI培地でES細胞が死滅するのに、「FI幹細胞」という何かしらの細胞が樹立され、そこから、
キメラマウスが産まれてきているという事実を説明できない。

結構な工作活動が、若山先生の幹細胞の樹立実験に絡んで、何者によってなされたということになるのだけど、
本人の告白でもない限り、結局は、誰がしたのかは、分からないままだろうね。

調査委員会には、残された試料を、しっかりと調べてもらいたい。

。
207：名無しさん：2014/12/22(月) 10:16:03: >>205
そうだね。若山氏の担当だった。
実験工作がなされているとなれば、実験に関係した人たち皆を疑う必要があるね。
208：名無しさん：2014/12/22(月) 15:01:49: >>207
調査委員会が、小保方さんのほかに若山さんや丹羽さんも調べているんでは。
ノートやデータなど出して、実験した範囲と内容が特定され、
サンプルの解析もされたら、誰が細胞すり替えをする機会があったのかもわかってくるのではないか。
マウスのすり替えについても調べているのかもね。

誰々の担当、というのもよく調べたほうがいいと思う。
各関係者が証言していることを鵜呑みにするのではなく、客観的な資料から。
圧倒的に疑義が多いのは小保方さんの担当部分だから、そこと他の関係者との動きややりとりも
俯瞰的に見ることも必要だと思う。
209：名無しさん：2014/12/22(月) 16:21:48: ＦＩ肝細胞は特許の関係では若山さんといわれていたが
小保方論文が疑われだしてから関さんが若山さんに確認したときは
自分は関与してないといっていたと証言している。
210：名無しさん：2014/12/22(月) 16:25:03: 問題はやはりキメラを作ったときの細胞とその時期のＳＴＡＰ幹細胞よね。
この肝細胞は若山さんが作っていてしかも株が残されている。
今のねつ造ストーリーではこれはそもそもＥＳ細胞であるはずだ。
他のものである可能性は説としても出てない。
211：名無しさん：2014/12/22(月) 16:29:36: 小保方さんがＥＳ細胞を偽ってスフィアだと称して若山さんに渡したのよね。
若山さんはそれでキメラを作った。キメラができるまで１ヶ月というから
一ヶ月前の打ち合わせって９月だったんだね。勘違いして１０月だと思ってた。
９月に打ち合わせて、１０月に移植して、１１月に成功した。
212：名無しさん：2014/12/22(月) 16:32:35: 若山さんが疑われるとしたらここだよね。
小保方さんは所詮自家蛍光を多能性発現だと勘違いしてただけなのに
また事実ずっと出来ていなかったのに、突然出来たから、若山先生が
何らかの理由で細工したのではと疑われた。特に男女関係を疑われていた。
213：名無しさん：2014/12/22(月) 16:36:41: そこは既にクリアされてる。
それ以前に小保方さんは博論で自力でテラトーマとキメラを作っている。
物理刺激だけどね。完全に死んでる細胞からテラトーマ、キメラは
できない。若山さんが細工したというなら、博論の実験は誰が細工したのかな。
214：名無しさん：2014/12/22(月) 17:03:00: この場所、あんまり雑談で潰して欲しくないんだけどね。
データの置き場のつもりだったんだけど。
215：名無しさん：2014/12/22(月) 17:43:04: >>214

データ管理ならフリーのWebサイトにでも置けば？
リンクくらい張れるっしょ。
216：名無しさん：2014/12/22(月) 18:46:11: 　誰がFIをつくって、誰がFIでキメラを作ったんだ。はっきりしてくれ！
217：源氏蛍 ◆VnRg4xmClA：2014/12/22(月) 18:57:08: >>204

そうだと思いますよ。

それ以外の可能性を考えてみましたが、一度キメラ作成に成功したあとは好調なペースでキメラができていっていますので、そうとしか考えられません。

今回の検証実験の結果を見ると、細胞を酸処理するとランダムに遺伝子が発現するということかもしれないので、もしも酸処理により遺伝子の発現量が下がる場合もあるのであれば、奇跡的な今回調べていな))い分化マーカー遺伝子の発現が消えるという現象
218：名無しさん：2014/12/22(月) 19:06:49: >>215

自分達こそいくらでも空いたつまんないスレがあるじゃないか。
219：源氏蛍 ◆VnRg4xmClA：2014/12/22(月) 19:09:33: すみません。送信ミスしました。
訂正の上、再送信します。

>>204

そうだと思いますよ。

それ以外の可能性を考えてみましたが、一度キメラ作成に成功したあとは好調なペースでキメラができていっていますので、そうとしか考えられません。

今回の検証実験の結果を見ると、細胞を酸処理するとランダムに遺伝子が発現するということかもしれないので、もしも酸処理により遺伝子の発現量が下がる場合もあるのであれば、奇跡的な確率ながら、今回調べていない分化マーカー遺伝子の発現が全て大幅に低下し、多能性マーカー遺伝子の全てが高いレベルで発現する細胞が1つくらい現れるという現象が起こるのかもしれません。
小保方さんの執念がその低い確率を引き寄せ、細胞塊ごと注入する方法であれば細胞塊の中にひとつでもそういう細胞が含まれていればキメラはできるのかも、とも考えてみましたが、
そのような天文学的な低確率で当たりを引き続けることがあるとは思えませんので、少なくとも2体目のキメラ以降はES細胞によるものだと思われます。
220：名無しさん：2014/12/22(月) 19:10:18: >>
217

//////
ーーーー
●　　　●　　ＥＳ+胎盤も免疫染色で確認したという
　　へ　　　　小保方の嘘の組み合わせというトリックですね。
221：名無しさん：2014/12/22(月) 19:14:26: >>219

//////
ーーーー
●　　　●　　１体目が本物で２体目が偽物なんて考えなくていいでしょう。
　　へ　　　　それは悪質なねつ造詐欺ですね。未熟さゆえに迷惑かけたのではありませんね。
222：名無しさん：2014/12/22(月) 19:15:24: >>216

　「会見の中で若山さんは、STAP幹細胞と同様に「FI幹細胞を樹立したのは自分だが、FI幹細胞にMEKiおよびJAKiを添加した実験は小保方さんが行った。」と発言していました。」
223：源氏蛍 ◆VnRg4xmClA：2014/12/22(月) 19:25:35: >>213
早稲田の調査報告書を読むと、博論のときのテラトーマは小保方さんの作成ですが、キメラは若山さんに依頼して作ってもらっていたようです。

ttp://www.waseda.jp/jp/news14/data/140717_committee_report.pdf
224：源氏蛍 ◆VnRg4xmClA：2014/12/22(月) 19:43:28: >>220
STAP細胞が胎盤にも分化するというのは、最初は胎盤内に胎児側から伸びている血管とその中の血液が光ったのを誤認したもので、
丹羽さんが見たという「確実に胎盤側までSTAP細胞由来の組織が入り込んでいる標本」は、ES＋TSで作ったか、一部で報告されている特定の条件の下でESが胎盤に分化する現象によるものではないかと考えています。
225：名無しさん：2014/12/22(月) 20:52:30: >>224

//////
ーーーー
●　　　●　　誤認とは？またなんと中途半端な判断なのでしょうか。
　　へ　　　　　あたかもキメラそのものをＥＳでねつ造させたことを
　　　　　　　　　忘れているかのように聞こえますよ。
226：源氏蛍 ◆VnRg4xmClA：2014/12/22(月) 22:39:33: 胎盤が光っていると最初に言い出したのは、小保方さんではなく若山研のメンバーの誰からしいですから。

あとここはあまり消費したくない人がいるようですので、以降の議論は別のスレッドで行いましょう。
227：名無しさん：2014/12/23(火) 08:00:11: 源氏蛍様、有難うございます。クラークケントは左右の人差し指で
一文字ずつポツリポツリとタイプライターを叩いて記事を書きながら
同時に網膜の裏に事件を見ると、突然、背広を脱ぎ捨てると新聞社の
窓を開け空高く飛び出して行くのでした。
日本語入力の私は右手の中指一つで５０音を拾いながら、今欣喜雀躍の
感情の余りピョンピョンと麻原空中浮揚を実践している様を書き連ねて
いるのでした。
228：名無しさん：2014/12/23(火) 10:38:00: memoより

「・FI-SCを樹立して、キメラを作る実験は行ったが、薬剤感受性の実験は小保方さんが担当した。」

　「・FI幹細胞は若山研に１～2系統あるが、検証はTS細胞に詳しくないこともあり自分の方でやる事は考えていない。」
229：名無しさん：2014/12/23(火) 22:35:07: やっぱり、FI-SC樹立、そこからキメラを若山さんがやったんだ～。
逃げられませんな。
230：名無しさん：2014/12/24(水) 09:19:22: 小保方さん、博論で行き詰ってたのね。
誰かが打開してやった。ここでも誰かさんはメールの事実を確認していない。
231：名無しさん：2014/12/24(水) 09:49:46: なんか不可解な事件だね。
ティシュー論文のアブストラクトあったよね。
あれ頼むよ。
232：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/24(水) 09:52:12: また、俺かよ。でも小保方さんも理研を退職して、こっちも
第三者調査委員会の報告までやることないからなあ。

（概要）
成熟した成体組織は適切な環境を維持するとき、通常は胚発生の初期段階に関連する多くの遺伝子を発現する幹細胞を含む。三胚葉のすべてを代表する成体組織（脊髄、筋肉、および肺）から調達された細胞は、それぞれが3胚葉すべての細胞を代表する細胞に成熟する可能性を示しながら。　　　　　異なる胚葉由来の成体組織から単離された細胞は、細胞の不均一な集団で構成された非接着性クラスター又は球として増殖させた。
233：名無しさん：2014/12/24(水) 09:53:41: 変な訳文だな。
234：セント・パンテレイモン・ふふふ三世：2014/12/24(水) 09:55:35: 原文がおかしいのよ。文章の編集切り貼りしているときにおかしくなったんだろうね。

クラスタまたはスフィアが解離されたとき、細胞はいくつかの世代の間に非付着性スフィアを新しく作り直す能力をもった。生体に移植されたとき、免疫不全マウスへの生分解性立脚点に関連して、三胚葉に特徴的な細胞を含む組織を生成した。これらの知見は、成体組織中の、全く違う、以前に考えられていたより生殖系列全体での分化により大きな効力を示した胚性幹（ＥＳ）細胞とは峻別される、幹細胞集団の存在を示唆している。このような細胞は組織工学および再生医療分野において潜在的に胚性幹（ＥＳ）細胞と同じくらい有用であり得る。
235：名無しさん：2014/12/24(水) 09:57:53: 免疫不全マウスに移植したらちゃんと再生してきたんだから、
死んだ細胞ではないし、当然何らかの幹細胞ではあるのよね。
新発見かどうかは別問題としても。
236：名無しさん：2014/12/24(水) 09:59:48: 今となってはそこも本当にやった実験なんですかという疑いが
もたれてしまってる。
237：名無しさん：2014/12/24(水) 10:05:02: でもどっちかなんでしょ。嘘か本当か。
本当ならここまでは三胚葉由来器官の中にまだそれぞれの未分化細胞があって、
肺からとった物は肺になり、神経からとった物は神経になり、骨髄から
とったものは骨髄になったという趣旨よね。後の博論から推論するに。
238：名無しさん：2014/12/24(水) 10:09:13: でもピペットで吸い取ってそれぞれの器官からそれぞれの幹細胞を取り出せた
ということが既に信じがたいし、免疫不全マウスに移植したらそれぞれの
器官に特徴的な細胞が出来たというのも信じがたくないか？
239：名無しさん：2014/12/24(水) 10:11:38: 器官幹細胞というのは既にいろんなものが知られているけど
こんなに簡単に大きさだけでは選別できないし、何を選別したかは
分からないが、それが全部三胚葉器官に特徴的な細胞になったというのも
あまりに簡単すぎる。嘘だと思うよ。
240：名無しさん：2014/12/24(水) 10:13:08: じゃあ、嘘だとして、博論はティシューの成果を繰り返しているだけよね。
241：名無しさん：2014/12/24(水) 10:14:06: そこにキメラの実験が加わるのよ。それは若山研に持ち込んで依頼したということが
分かってる。
242：名無しさん：2014/12/24(水) 10:14:47: でも嘘なんだから何もないわけでしょ。何を持ち込んだのよ。
243：名無しさん：2014/12/24(水) 10:19:25: いろんなことを試したことになってるんだけど、ピペットで小さい細胞を
吸い出したものを培養したものさ。スフィアと呼んでいる。他の論文にもある
概念よ。
244：名無しさん：2014/12/24(水) 10:20:45: それはもはや何にでもなる細胞なのかい？
245：名無しさん：2014/12/24(水) 10:25:53: いつのまにか博論ではバカンティの胞子様細胞になってる。つまり三胚葉の
それぞれの器官の幹細胞ではなく、もっと未分化な細胞になってる。
246：名無しさん：2014/12/24(水) 10:26:32: それはティシュー論文と整合しないのでは？
247：名無しさん：2014/12/24(水) 10:29:27: いや、博論では、培地によって三胚葉に分化するんだよ。だから何でもに
なる細胞だけど、骨を形成させたかったらそういう培地で骨に誘導しないといけない。
その辺の事情はティシューはアブストラクトだけしか手に入れてないから
どういうことをしたか判断できない。
248：名無しさん：2014/12/24(水) 10:32:52: じゃあ、嘘か本当か、この時点ではまだ判断出来ないということ？
249：名無しさん：2014/12/24(水) 10:37:06: そういうことになるかな。ただ注意しないといけないのは、ここまで全て
何か分からないスフィアなるものから現実のテラトーマなり、免疫不全マウスでの
組織が出来てると書いてあることよ。今回の再現検証実験では何も出来なかった。
ここの乖離が何時始まったかということだね。最初からではないかという疑いが
一番強いんだけど、途中に介在していらんことした人が居なかったかという
疑いが何時までも残っているのさ。その疑いが晴らせるかということ。
250：名無しさん：2014/12/24(水) 10:38:44: なるほど。じゃ博士論文見せてよ。
251：名無しさん：2014/12/24(水) 10:40:34: これが又下書き草稿を提出してしまったということになってる。
ただ小保方さんによる日本語概要がついてるよ。

早稲田大学大学院先進理工学研究科
博士論文概要
論文題目
Isolation of pluripotent adult stem cells
discovered from tissues derived from all three germ layers
三胚葉由来組織に共通した
万能性体性幹細胞の探索
申請者
Haruko
Obokata
小保方
晴子
生命医科学専攻環境生命科学研究
2010年 12月
252：名無しさん：2014/12/24(水) 10:41:08: 体性幹細胞は、成体の体内に実際に存在し、生体の恒常性を保つため老化細胞の代替となる若い細胞を生み出し、炎症などの生体反応に応答して失われた細胞を補充する役割を担っていると考えられている。現在までに、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞は多種の分化可塑性を有する体性幹細胞として研究が進められている。また、前駆細胞との区別が難しいが、各種生体組織にはそれぞれの組織幹細胞が存在していると考えられており、多くは培養系においてその存在が認められている。間葉系幹細胞研究に代表されるように、体性幹細胞の研究は発生学的な観察に基づき展開されている。哺乳類の発生において三胚葉分化は決定的な過程であり、体性幹細胞の多くも三胚葉分化の後に存在が確認されることから、三胚葉分化が起こった後は、例えば外胚葉系組織に存在している幹細胞が中胚葉や内胚葉由来組織の細胞に分化する、中胚葉系に存在している細胞が外胚葉・内胚葉由来組織の細胞に分化すると言った、いわゆる胚葉を超えた分化は起こりえないと考えられている。しかし近年、分子生物学的解析手法の発展により間葉系幹細胞の一部は外胚葉系の細胞から構成されることや、間葉系幹細胞が生体内で神経形成に関与するなどといった、いわゆる胚葉を越えた分化が三胚葉形成の後にも起こっていることが報告されている。これらの報告により、体性幹細胞の起源や分化能の限界についての大前提に疑問がもたれるようになってきている。
253：名無しさん：2014/12/24(水) 10:41:40: Vacantiらは2000年に、全身の生体の組織内には三胚葉由来によらず非常に強いストレスに耐性を有するspore-like stem cellが存在し体性幹細胞の補充に寄与している可能性を提唱してきた。その後、他の研究グループからも同様な概念に基づいた研究報告が相次いでいる。2002年には骨髄中に万能性幹細胞MAPCが存在することが報告され、2004年には間葉系幹細胞の一部に分化万能性を有するMIAMI cellが存在することが報告され、2006年には造血幹細胞の小さいサイズの分画の中にVSELS cellsが存在することが報告され、2010年には間葉系細胞の一部にストレス耐性のmuse cellsが存在することが報告されている。本研究では、spore-like stem cellの仮説を証明する第一歩として、全身の組織に共通の性質を持つ幹細胞が存在することを証明することを目標とし、幹細胞の採取、解析、再生医療研究応用への可能性を検討した。第一章では、生体組織由来のpluripotent stem cellに関する研究の動向を概説し、本研究の背景をまとめると共に、本研究の意義及び目的を明らかにした。
254：名無しさん：2014/12/24(水) 10:42:15: 第二章では、spore-like stem cellの採取法を検討すると共に、幹細胞マーカーの発現を解析した。Spore-like stem cellsは細胞直径が非常に小さいという特徴を有しているため、小さい細胞を採取する方法を施行した。まず、cell sorterを用いてBlack6 マウスの骨髄細胞から、直径６μｍ以下の細胞のみを回収した。続いて低浸透の溶液で細胞を短時間処理することによって、大きな細胞の細胞膜を破壊し小さな細胞のみを回収した。また先端を10μｍほどまで細めたガラスピペットで細胞を粉砕することによって小さい細胞を回収した。それぞれの方法で回収した細胞群を無血清培地で培養を行うと浸透圧処理または粉砕処理によって回収された細胞群から浮遊した球形のコロニー形成（以降sphereと呼ぶ）が確認された。粉砕処理を行った場合、高頻度にsphere形成が観察された。sphere形成の数は年齢依存的であり、生後４週齢のマウスからは生後8週齢のマウスの約二倍の数が観察された。Sphere形成は幹細胞の強い自己複製増殖能の結果として現れる現象であると考えられているため、免疫染色により、幹細胞マーカーの発現解析を行った。まず間葉系幹細胞や造血幹細胞など広範な体性幹細胞に発現が報告されているc-kitとSca-1の発現を調べた結果、多くのsphereに発現が確認された。続いてES細胞や発生初期の受精卵に発現が観察される万能性幹細胞マーカーであるSSEA-1とE-cadherinの発現を調べた結果、これらも多くのsphereに発現が確認されることが明らかとなった。
255：名無しさん：2014/12/24(水) 10:42:57: タンパク質レベルでの万能性幹細胞マーカーの発現が確認されたことから、遺伝子レベルでの万能性幹細胞マーカーの発現をES細胞の遺伝子発現と比較して検討を行った。特に、タンパク質レベルでのマーカーの発現強度は個々のsphereによって異なっていたため、個々のsphereは異なる遺伝子発現パターンを示すのではないかと言う予想の下、sphere一つ一つを顕微鏡下で採取し遺伝子発現の解析を行った。その結果、Oct4, Nanog, Sox2, Ecat1, Cripto, Esg1など万能性幹細胞に特異的に発現が見られる遺伝子マーカーが高頻度に発現していることが分かった。
256：名無しさん：2014/12/24(水) 10:43:31: 第三章では、これらの細胞の分化能をin vitro, in vivoの双方で調査した。ES細胞から三胚葉由来の細胞へ分化させるための培養条件を参考に、培養条件を設定し分化誘導実験を行った。その結果、sphere由来の細胞は神経・筋肉・肝実質細胞などの代表的な三胚葉由来組織細胞へ分化できることが確認された。生体内での分化能と増殖能を検討するために移植実験を行った。Sphereの細胞はPGA上に播種され、2-3日PGA（poliglycolic acid）上に細胞を接着させるために培養した後、NOD/SCIDマウスの皮下に移植した。4-6週間後に移植片を採取し、組織学的、免疫組織化学的に解析を行った。移植後直径３ｍｍほどのカプセル化した塊を形成した。内部には上皮、神経、筋肉、管といった三胚葉由来すべての組織形成が確認された。以上の結果から、粉砕処理後にsphereを形成する細胞は、無血清条件下で培養すると、非常に幼弱なタンパク質・遺伝子を発現し、培養系、生体内双方において三胚葉系由来組織への分化能を有することが示された。
257：名無しさん：2014/12/24(水) 10:44:05: 第四章では同様の細胞群がその他の組織にも存在しているかを確認するため三胚葉由来組織の代表的な組織である脊髄（外胚葉）、筋肉（中胚葉）、肺（内胚葉）から細胞を単離し、粉砕処理後、無血清培養条件下で浮遊培養を行った。タンパク質マーカーの発現は骨髄で行ったときと同様にc-kit, Sca-1, SSEA-1, E-cadherin陽性の細胞が確認された。遺伝子発現解析の結果、骨髄のときと同様、ES細胞に特異的な遺伝子の発現が多数確認された。特に肺由来のsphereからは高頻度にOct4陽性のsphere細胞塊が確認された。一方、脊髄からは多くのsphere形成が確認されるが、Oct4などのES細胞特異的な遺伝子マーカーを発現したsphereの割合は骨髄由来のsphereと比較して低い値を示した。培養系での分化誘導実験を行うと、骨髄のときと同様に、各特異的なマーカーで陽性を示す三胚葉由来組織の細胞へと分化した。さらにPGAに播種しNOD/SCIDマウスの皮下に移植すると、骨髄のときと同様に上皮、神経、筋肉、軟骨、腺といった三胚葉系の組織へと分化した。以上のことから、骨髄中から発見された広範な分化能を有する細胞群は、脊髄、筋肉、肺といったすべての三胚葉由来組織からも単離され得ることが確認された。
258：名無しさん：2014/12/24(水) 10:44:37: 第五章では、幹細胞の万能性を証明するための最も重要な証明方法であるキメラマウスの作成を幼弱神経幹細胞培養条件であるbFGF, LIF依存浮遊培養系によって培養したsphereを用いて試みた。ICRマウスの受精卵とsphereを用いた凝集法によってキメラ卵を作成し、24時間培養した後、子宮に移植した。20日後に産まれた新生児の毛皮にはsphere由来の毛が観察されなかった。また産まれてきた新生児の数は移植した受精卵の数よりも少なかった。キメラの胎生致死、もしくは特定の組織への貢献、もしくは低頻度での貢献の可能性が考えられたため、胎生12.5日目の胎児の解析を行った。その結果全身にsphere由来の細胞が散在していることが確認された。このことから、sphere由来の細胞は全身の組織形成に寄与できる能力を有していることが明らかとなった。
259：名無しさん：2014/12/24(水) 10:45:18: 第六章では本研究の総括と展望について述べた。本研究ではこれまでの常識を超えた体性幹細胞の起源と分化可能性についての新しい学説をもとに、体性幹細胞の創生の可能性を探る実験を試みた。本研究で得られた幹細胞が実際に生体内に存在するかどうかは、これから明確にすべき大きな課題である。しかしながら培養法をさらに効率化することによって大量培養を可能とし、組織工学をはじめとする再生医療研究の新たな細胞ソースとして期待できる。また、これまでiPS細胞を始めとした万能性幹細胞の創生の研究が盛んに行われているが、再生医療研究に必要なのは安全に機能する体性幹細胞であり、万能性幹細胞からの体性幹細胞の分化誘導は難しい。そこで本研究の第四章で検討したような体性幹細胞を体細胞から創出する試みが成功すれば細胞生物学的にも発生学的にも非常にインパクトのある研究成果となり、再生医療応用に最も適した細胞ソースを提供できるようになるものと期待される。
260：名無しさん：2014/12/24(水) 10:53:56: 早稲田大学博士（工学）学位申請研究業績書
氏名小保方晴子印
（２０１０年１１月現在）
種類別
題名、発表・発行掲載誌名、発表・発行年月、連名者（申請者含む）
報文
○
講演（海外）
(1) Haruko Obokata, Masayuki Yamato, Kohji Nishida, Satoshi Tsuneda, and Teruo Okano, "Subcutaneous transplantation of autologous oral mucosal epithelial cell sheets fabricated on temperature-responsive culture dishes", Journal of Biomedical Materials Research: A 86:1088-96. 2007
(2) Haruko Obokata, Koji Kojima, Masayuki Yamato, Satoshi Tsuneda, Charles A. Vacanti, “The potential of stem cells in adult tissues representative of the three germ layers.”
Tissue Eng Part A. 2010 in press.
(3) Haruko Obokata, Masayuki Yamato, Kohji Nishida, Satoshi Tsuneda, and Teruo Okano,
“Time-course アナリシーズ of reconstructed ultrastructure change in oral mucosal epithelium cell sheet after subcutaneous transplantation” submitted to Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine.
(4) Haruko Obokata, Masayuki Yamato, Satoshi Tsuneda, and Teruo Okano, “Protocol for reproducible subcutaneous transplantation of cell sheets” submitted to Nature Protocols.
(5) Haruko Obokata, Masayuki Yamato, Satoshi Tsuneda, and Teruo Okano, “The effectiveness of inflammatory cytokines for regeneration of transplanted cultured keratinocyte cells” submitted to Journal of Investigative Dermatology
(6) Haruko Obokata, Masayuki Yamato, Satoshi Tsuneda, and Teruo Okano, “Hyperacute inflammation アナリシーズ after subcutaneous transplantation of human fibroblast cell sheets into Lewis rats.”submitted to Xenotransplantation.
(1) Haruko Obokata, Masayuki Yamato, Kohji Nishida, Satoshi Tsuneda, and Teruo Okano, "Subcutaneous transplantation of autologous oral mucosal epithelial cell sheets fabricated on temperature-responsive culture dishes", Society for Biomaterials 2007 Annual Meeting, Chicago, IL, April 17-21, 2007.
(2) Haruko Obokata, Masayuki Yamato, Kohji Nishida, Satoshi Tsuneda, and Teruo Okano, "Time-course observation of subcutaneous transplanted autologous oral mucosal epithelial cell sheets fabricated on temperature-responsive culture dishes",, The 13th World Congress of International Society for Artificial Organs, IFAO-JSAO Annual Meeting, Osaka, Japan, Jun 28-31, 2007
(3) Haruko Obokata, Masayuki Yamato, Kohji Nishida, Satoshi Tsuneda, and Teruo Okano, "Inflammatory アナリシーズ of subcutaneously-transplanted human epithelial cell sheets", Termis-AP, Tokyo, Japan, December 3-5, 2007