非ヒトＥＳ動物の新規作成方法 - 1524174236

1：司書：2018/04/20(金) 06:43:56: 【発明の名称】
非ヒトＥＳ動物の新規作成方法

【発明者】
【氏名】大田浩
【氏名】坂出祐子
【氏名】山縣一夫
【氏名】若山照彦

【課題】４倍体胚をホストとする非ヒトＥＳ動物の作成方法において、効率的に非ヒトＥＳ動物を得る方法を開発する。
27：司書：2018/04/20(金) 07:01:34: 【００３７】
ＥＳマウスの最大の特徴は、体を構成しているほぼ全ての細胞がＥＳ細胞由来であるという点である。表１に示したように、３ｘ４倍体胚では、総細胞数のみならず、体を構成しうるＩＣＭ細胞も増加している。最後に、３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスが実際にＥＳ細胞由来の細胞で構成されているかを検討した。
【００３８】
ホストである４倍体胚由来の細胞とＥＳ細胞を区別するため、ＥＳ細胞にはＥ１４、ホストにはＩＣＲＧＦＰ由来の４倍体胚を使用した。このことにより、４倍体胚由来の細胞がＧＦＰを発現するため、ＥＳマウスにて４倍体由来の細胞を容易に確認することが可能となる。この方法を用いて、３ｘ４倍体胚から合計１５匹のＥＳマウスを作成し、蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。図３に示すように、得られた１５匹すべてにおいて、胎盤でＧＦＰが発現し、産仔では発現していなかった（図３Ａ－Ｃ）。これらの結果から、３ｘ４倍体胚を使用してもＥＳマウスに４倍体胚由来の細胞が大きく混入する可能性は低いと考えられる。次に、より詳細な解析を行うため、フローサイトメトリーによるＧＦＰ細胞の検出を行った。１ｘおよび３ｘ４倍体胚より作成したＥＳマウスをそれぞれ２匹ずつ使用し、脳および肝臓におけるＧＦＰ陽性細胞を検出した。解析の結果、１ｘおよび３ｘ４
28：司書：2018/04/20(金) 07:02:57: 【００３９】
倍体胚由来のＥＳマウスとも、４倍体胚由来のＧＦＰ細胞の混入率は１％未満であった。
以上の結果から、３ｘ４倍体胚を用いたＥＳマウスは、従来法に由来するＥＳマウスと同様に、ほぼ全ての構成細胞がＥＳ細胞由来であることが証明された。
（表３、ＥＳマウスの表現型の解析）
【表３】

a平均±SD(g)。
bOE:開眼、AH:腹部ヘルニア、LO:巨大産仔、OELO:開眼および巨大産仔を併発した仔、OEAH:開眼および腹部ヘルニアを併発した仔。
29：司書：2018/04/20(金) 07:03:37: 【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、トランスジェニック動物やノックアウト動物のごとき遺伝子改変非ヒト動物を効率的に作成する方法およびこの方法により作成された遺伝子改変非ヒト動物を提供する。そのため、病理学的な研究や新治療法の開発に用いる実験動物の製造、新薬の開発をはじめとする多くの産業分野において利用可能である。
30：司書：2018/04/20(金) 07:04:29: 【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、倍化４倍体胚の細胞数の解析結果を示す。Ａ－Ｅは１ｘから３ｘ４倍体胚および正常胚（１ｘ２ｎ）をＰＩ染色した写真、Ａ’－Ｄ’は１ｘから３ｘ４倍体胚および正常胚（１ｘ２ｎ）をＣｄｘ２で免疫染色した写真、Ａ”－Ｄ”はそれぞれの写真を合成した写真である。Ａ－Ａ”は１ｘ４倍体胚、Ｂ－Ｂ”は２ｘ４倍体胚、Ｃ－Ｃ”は３ｘ４倍体胚、Ｄ－Ｄ”は正常胚（１ｘ２ｎ）、Ｅ－Ｅ”は３ｘ４倍体胚をＰＩ（Ｅ）、Ｏｃｔ３／４（Ｅ’）で染色した写真、およびその合成写真をＥ”として示した。スケールバー：Ａ”－Ｄ”１００μｍ。Ｅ”２００μｍ。
【図２】図２は、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１を用いた４倍体胚とのキメラ胚の作成を示す。Ａ－Ｃは１ｘ４倍体胚とＥＳ細胞（１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ）のキメラ胚、Ｄ－Ｆは３ｘｘ４倍体胚とＥＳ細胞（１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ）のキメラ胚を示す。Ａ、Ｄは可視光写真、Ｂ、Ｅは蛍光写真、Ｃ、Ｆはそれぞれの合成写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図３】図３は、３ｘ４倍体胚から作出されたＥＳマウスの解析である。（Ａ－Ｃ）ＧＦＰを発現する３ｘ４倍体胚とＥ１４ＥＳ細胞を用いたＥＳマウスである。（Ａ）可視光写真を示す。（Ｂ）蛍光写真を示す。（Ｃ）ＡとＢの合成写真を示す。胎盤においてのみ４倍体胚由来（ＧＦＰ陽性）の細胞が確認される。（Ｄ、Ｅ）フローサイトメトリーによる解析結果である。１ｘ４倍体胚由来のＥＳマウス（Ｄ）および３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウス（Ｅ）の脳（左パネル）および肝臓（右パネル）におけるＧＦＰ陽性細胞の存在頻度を解析した。１ｘおよび３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスともＧＦＰ陽性細胞の存在頻度は１％未満であった。
31：司書：2018/04/20(金) 07:05:06: 【出願人】
【識別番号】５０３３５９８２１
【氏名又は名称】独立行政法人理化学研究所

【出願日】
平成２０年１月４日（２００８．１．４）
32：司書：2018/04/20(金) 07:05:40: 【代理人】
【識別番号】１０００８１４２２
【弁理士】
【氏名又は名称】田中光雄

【識別番号】１０００８４１４６
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎宏
33：司書：2018/04/20(金) 07:06:14: 【識別番号】１００１１６３１１
【弁理士】
【氏名又は名称】元山忠行

【識別番号】１００１２２３０１
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田憲史
34：司書：2018/04/20(金) 07:07:06: 【公開番号】
特開２００９－１５９８７８（Ｐ２００９－１５９８７８Ａ）

【公開日】
平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）

【出願番号】
特願２００８－８９（Ｐ２００８－８９）
35：ふむ：2018/04/20(金) 07:07:38: 😭　😃　😵　😒　😣　😝　😔　😳　😡　😱　🐝　🌅　👰　🙅　🙍
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36：鉄：2018/04/20(金) 07:19:58: イェイ。
37：鉄：2018/04/22(日) 06:53:38: イェイ。
38：鉄：2018/04/23(月) 06:00:43: イェイ。
39：鉄：2018/04/24(火) 06:25:19: イェイ。
40：鉄：2018/04/25(水) 03:11:29: イェイ。
41：鉄：2018/05/04(金) 05:37:44: イェイ。
42：鉄：2018/05/04(金) 18:02:06: イェイ。
43：鉄：2018/05/05(土) 04:32:53: イェイ。
44：鉄：2018/05/05(土) 11:50:21: イェイ。
45：鉄：2018/05/09(水) 10:42:50: イェイ。
46：鉄：2018/05/26(土) 07:33:31: イェイ。
47：鉄：2018/05/27(日) 11:48:47: イェイ。
48：鉄：2018/06/04(月) 11:37:49: イェイ。
49：鉄：2018/06/20(水) 05:55:15: イェイ。
50：鉄：2018/07/07(土) 07:39:59: イェイ。
51：鉄：2018/10/04(木) 04:17:45: イェイ
52：ふむ：2018/10/21(日) 07:42:58: ふむ
53：ふむ：2018/10/25(木) 06:25:31: ふむ
54：名無しさん：2018/12/06(木) 06:35:52: ふむ
55：名無しさん：2018/12/08(土) 07:13:18: ふむ
56：名無しさん：2018/12/19(水) 20:51:34: ふむ
57：名無しさん：2018/12/27(木) 05:24:23: ふむ
58：名無しさん：2019/01/07(月) 04:24:27: ふむ
59：名無しさん：2019/01/31(木) 20:22:15: ふむ
60：名無しさん：2019/02/05(火) 07:23:50: ふむ
61：名無しさん：2019/02/05(火) 11:00:33: ふむ
62：名無しさん：2019/02/05(火) 17:29:56: ふむ
63：名無しさん：2019/02/05(火) 18:50:53: ふむ
64：名無しさん：2019/02/05(火) 21:03:44: ふむ
65：名無しさん：2019/02/06(水) 07:01:18: ふむ
66：名無しさん：2019/02/06(水) 08:22:17: ふむ
67：名無しさん：2019/02/06(水) 21:34:43: ふむ
68：名無しさん：2019/02/07(木) 11:46:04: ふむ
69：名無しさん：2019/02/07(木) 20:47:37: ふむ
70：名無しさん：2019/02/08(金) 09:10:54: ふむ
71：名無しさん：2019/02/09(土) 20:38:31: ふむ
72：名無しさん：2019/02/10(日) 09:31:48: ふむ
73：名無しさん：2019/02/11(月) 05:17:13: ふむ
74：名無しさん：2019/02/14(木) 09:50:02: ふむ
75：名無しさん：2019/02/16(土) 18:57:14: ふむ
76：自死の自由を！安楽死施設をつくりましょう！：2020/07/24(金) 09:14:26: 自死の自由を！

安楽死施設をつくりましょう！