HEK293Tでのルシフェラーゼアッセイについて

1：JH：2010/07/21(水) 10:56:08: はじめまして、JHと申します。
質問があって書き込ませていただきます。

HEK293TにNF-kBレポータ遺伝子と各種TLR、NLRs遺伝子を導入し、TKプロモータレポータ遺伝子を
標準化用に導入して、細菌による刺激を調べようとしています。

ところが、どうしてもリガンドを接触させていないサンプルで、NF-kB活性が起きてしまいます。(起きないときもありますが)
HEK293Tに使用している培地やアッセイ試薬にリガンドがコンタミしていることはなさそうです。
なぜかTLR5とTLR9ではうまくいきますが・・・
(NF-kBレポータ遺伝子を安定発現させたRAW264細胞で、テストしました。）

また、HEK293Tのアッセイで使用しているコラーゲンコートの24well plateで、コラーゲンが認識されているのではと考え、
そちらでもRAW264によるテストを行っています。

みずほさんの経験上、このような現象がなぜ起きるか教えてくだされば光栄です。
11：JH：2011/02/05(土) 20:02:13: ちなみにプラスミドは大腸菌から精製しています。
HEK293にTLR9を発現させた系において、刺激をしていない場合、NF-kBの活性は一切見られません。
某Mさんがおっしゃるような非メチル化CpG配列の影響は受けていないと思います。
12：みずほ：2011/02/06(日) 02:41:51: TLRうまくいってよかったですね。
Nod1,Nod2はプラスミドを変えてみてはどうですか？
うちには何種類かプラスミドがあって、よくわからないですが、リガンド応答性が良いもの、悪いものがあります。
刺激時間は、私はもっと長い（16時間）ですが、それが影響するかは試したことがないのでわかりません。
13：M本：2011/02/11(金) 23:34:27: >>11
それはTLR9のステイブルの系ですか？
14：JH：2011/02/19(土) 19:29:02: M本さん
　いえ、一過的に発現させた系です。
15：M本：2011/05/19(木) 01:17:18: 私の結果とは違いますね。まあ私は直接ｋBのレポーターをやったわけではありません。
LTRをプロモーターに使いました。LTRはCpGのメチル化によって発現抑制が起こります。
非メチル化LTRではｋB非依存的に発現が起こったんで。
16：名無しさん：2014/05/02(金) 10:01:08: TLRとNODのレポーターアッセイは293以外の細胞（例えばMEFやNIH3T3, HeLaなど）でも293と同様にレポーターの誘導は見られますか？
ノックアウトマウス由来のMEFを使いたいのですが、論文で293以外を使っているのを見たことがありません。

ノックアウトの解析はマクロファージなどを単離して刺激し、サイトカイン産生を測定するのが定番のようですが、ノックアウト細胞に何か遺伝子を（過剰）発現させて解析したい場合
MEFのほうがとランションし易いので利用したいのですが、MEFでもアッセイできるかご存知でしたら教えて下さい

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