HEK293Tでのルシフェラーゼアッセイについて

10：JH：2011/02/05(土) 17:39:19: お久しぶりです。

あの後、みずほさんに言われたように、DNA量を調整した結果、だいたいのHEK293のTLRs
アッセイ系は、うまくいきました。

しかし、NOD1,NOD2のアッセイ系は受容体DNA量の調整では、どうしてもうまくいきません。
リン酸カルシウム法でトランスフェクションしています。刺激時間は6時間です。
アゴニストは必要量入れています。同じ方法で、TLRを発現させた系ではうまくいきます。

何か良い解決策があれば、ぜひご教授願います。
11：JH：2011/02/05(土) 20:02:13: ちなみにプラスミドは大腸菌から精製しています。
HEK293にTLR9を発現させた系において、刺激をしていない場合、NF-kBの活性は一切見られません。
某Mさんがおっしゃるような非メチル化CpG配列の影響は受けていないと思います。
12：みずほ：2011/02/06(日) 02:41:51: TLRうまくいってよかったですね。
Nod1,Nod2はプラスミドを変えてみてはどうですか？
うちには何種類かプラスミドがあって、よくわからないですが、リガンド応答性が良いもの、悪いものがあります。
刺激時間は、私はもっと長い（16時間）ですが、それが影響するかは試したことがないのでわかりません。
13：M本：2011/02/11(金) 23:34:27: >>11
それはTLR9のステイブルの系ですか？
14：JH：2011/02/19(土) 19:29:02: M本さん
　いえ、一過的に発現させた系です。
15：M本：2011/05/19(木) 01:17:18: 私の結果とは違いますね。まあ私は直接ｋBのレポーターをやったわけではありません。
LTRをプロモーターに使いました。LTRはCpGのメチル化によって発現抑制が起こります。
非メチル化LTRではｋB非依存的に発現が起こったんで。
16：名無しさん：2014/05/02(金) 10:01:08: TLRとNODのレポーターアッセイは293以外の細胞（例えばMEFやNIH3T3, HeLaなど）でも293と同様にレポーターの誘導は見られますか？
ノックアウトマウス由来のMEFを使いたいのですが、論文で293以外を使っているのを見たことがありません。

ノックアウトの解析はマクロファージなどを単離して刺激し、サイトカイン産生を測定するのが定番のようですが、ノックアウト細胞に何か遺伝子を（過剰）発現させて解析したい場合
MEFのほうがとランションし易いので利用したいのですが、MEFでもアッセイできるかご存知でしたら教えて下さい

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