ペーパー一枚への道　その1

1：地球の上に朝が来た、その裏側は夜だろう。：2019/03/11(月) 00:00:59: 😭　😃　😵　😒　😣　😝　😍　😆　😔　😳　😉　😴　🙄　🤔　😕　😡　😱　👿　
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327：閲覧者：2019/03/24(日) 06:22:41: 今までの検討の繰り返しになりそうだけど、ひとつづつチェックしたらどうだい。
<ＴＳさんの解析をみんなでわかって行こう。>が最新記事だね。
328：一言居士：2019/03/24(日) 06:41:29: 学さんが勝手に記事を加えていくからね。あれはTs.Markerさんがトゥイッターに
書いていることだ。あそこにこちらの要望を書いて置こう。
>>
>>Ts.Markerさん

私はIGVの見方がわかりません。濃く出ていれば発現が多い、薄いのは少ないという
素人感覚で〇X△と認識して分類しています。要望です。まず、今回のHH,H,X,N/A,L,LLの
意味を解説してください。次に、Tru-seq, SMARTer, ChIP-seqの区別を教えてください。
特に前者二つはどちらもRNASeqと書かれていて、どう違うのかがわかりません。たぶん、
どちらかが2012年8月の分析で、他方が2013年1月以降の分析でくわえられたのかとも推測しますが
分かりません。それから細胞種はES,STAP,STAP-SC,FI-SC,TSと分類されていますが、あなたの
分析したライン別に記載されてください。
329：一言居士：2019/03/24(日) 06:57:31: このデータはあなたしかお持ちでない(アルイミオウジ氏のところにもありますが)。
我々はあなたのブログに出ているものだけしか把握していません。現在どれだけ
分析が進んでいるのかは存じませんが、新しく加えられているデータがあったらそれも
更新していただければ有難いです。我々が今持っているデータは、
Tru-seq=ES560,STAP580,STAP-SC585,FI-SC565,TS590,EpiSC568CD45+556
SMARTer=ES574,STAP578(Bowti2,Tophat2)
SMARTer<otamesi>=STAP581(Sox21のみ)
ChIP-seq=ES563,STAP583,STAP-SC588,FI-SC568,TS593
ChIP-seq<やっぱりね>=FI-SC567,FI-SC568,FI-SC569
です。番号は560→SRR1171560の意味です。
330：一言居士：2019/03/24(日) 07:07:23: ご承知の通り、このデータの整理はいつ誰がどういう経緯で登録したのかも
わかっていません。例えばF1の細胞はすべてがC57BL/6x129/Svと記載されているんですが
中身が違っている。TSもすべてCD1と書かれていて丹羽研提供は桂報告書で
分かっていますが、遠藤さんが分析した590,591は若山さんの作ったF1のTSのようです。
この公共データ登録は小保方さんが一旦理研を経由して登録していて人の手が
介入しているようでもあります。ライン別にちゃんと識別されていなければならない理由です。
以上要望でした。
331：小野小町：2019/03/24(日) 07:29:51: とりあえず貼り付けてらっしゃいよ。
332：一言居士：2019/03/24(日) 07:30:40: 少し変えたけど貼ってきたよ。
333：閲覧者：2019/03/24(日) 07:31:47: 次は丹羽論文の記事に対してだね。
334：一言居士：2019/03/24(日) 07:33:14: かなりの誤解があるね。特に～10は10の3乗なんだけどアルイミオウジ氏と同じく
気づいてないね。
335：閲覧者：2019/03/24(日) 07:35:44: あそこは誤解されたままだとチンプンカンプンで、逆に丹羽論文の問題点が
隠されてしまうだろうね。
336：一言居士：2019/03/24(日) 07:46:49: >>学さん

アルイミオウジ氏も気づかれていなかったですが、～10は肩の小さい3が脱落しているんです。
10の三乗です。つまり～1000で、スフィア塊は最大1000個程度の細胞で構成されているという意味です。
このことはスフィア塊の写真を見ればわかる通りで10個以下なんてことはあり得ませんし、
ティシュー論文以来細胞塊は約1000個の細胞でできていると書き継がれていることでもあります。
誤植の類なんですけど、あの分析に丹羽さんが10個のESを基準にしていることでなんとなく曖昧に
気づかずに読み過ごされていることが多いようです。
337：一言居士：2019/03/24(日) 08:12:53: （図3b）は約1000個の細胞で構成されているスフィア塊を10個のES細胞のマーカー遺伝子
発現量と比較したものが19例並べてあるグラフです。メモリは対数表示で、Oct4に関して言えば
0.1のライン以上が4例あるということです。10個のESの発現量との比較ですから、0.1の近辺では
1個分が発現しているということです。1000個の中の1個です。しかも比較的発現のある19例を
並べてあるんですから、何もない事例もあるということです。1000個の19例だと19000ですが、
スフィア塊は20から30個程度形成されたと書かれています。で、結果的に最大30スフィアの20%つまり
最大6個のスフィアのそれぞれに1個か2個の内在性Oct4遺伝子発現があった。つまり最大12個あった
という結論なんです。それは最初の50万個の細胞に対しては0.0012–0.0024%であるということですね。
338：一言居士：2019/03/24(日) 08:20:56: これでもティシュー論文では試験管内三胚葉分化も足場付きテラトーマならできているわけです。
それは大量に入れた細胞の中の一個でも多能性細胞であれば分化するからですね。これが今でも
ヴァカンティが特許申請継続している理由です。
でも、相沢さんと丹羽さんの検証目的は理研の名前で出しているネイチャー論文の骨子通りに
特許も申請していますから、キメラが再現できるか否かだけが検証の目的で、
理研の予算を使って行っているのですから、ティシュー時の細胞が何であったかなどという
検証はやれません。目的が違うということです。結果は、再現できないから特許申請は
取り下げるというものです。
339：一言居士：2019/03/24(日) 08:31:59: そこの理解に関して一致できれば、今度は丹羽論文の曖昧さに関しても指摘できることに
なると思います。ES10個分の発現量と比較して0.1は1個分ですけど、これは一個だとは
言えませんよね。1/100が10個集まったら1/10です。1/1000が100個集まっても1/10です。
とても微量な発現がたくさんあるという可能性を否定できていませんね。（図4a）に2個の
スフィア塊の中で11個の個別細胞が免染で黄色く着色されているのが見えます。結論には
6個のスフィア塊の中に1から2個だったはずですね。これは1から2個分の発現と読み替え
ないといけないんでしょうね。
>>However, the frequency was very low; 5 × 105 liver cells yielded only ~30 cell aggregates, in which about 20% of the cell aggregates contained 1–2 Oct3/4 positive cells, indicating a frequency per seeded liver cell of 0.0012–0.0024%.
340：一言居士：2019/03/24(日) 08:35:00: 発現→発現量
341：一言居士：2019/03/24(日) 08:48:10: このことはGFPの蛍光に関しても言えるかもしれません。Ooboeさんのパートナー氏は
予備的再現実験時の小保方さんの作った自家蛍光ではない沢山の蛍光細胞の出現写真を
ガンバレブログにアップされています。亜致死酸浴下条件でOct4-GFPが内在性Oct4遺伝子発現に
正確に比例して発現するのか否かはわかっていません。こんな実験をしたのは
小保方さんが初めてだからです。丹羽さんも1割程度の漏れ出しという現象を発見しています。
分かってないことが多いですけど、前述した通り理研の検証実験は特許申請維持の可否検証が
目的ですので多くを要求することはできませんね。事件は複雑なので、多面的に検討していく
しかないと思っています。以上です。
342：小野小町：2019/03/24(日) 08:48:54: ま、その程度でいいでしょ。貼ってらっしゃいな。
343：一言居士：2019/03/24(日) 09:14:11: 貼ってきたよ。
344：閲覧者：2019/03/24(日) 09:14:55: じゃ、最後はヒートマップだね。
345：デラ・ストリート：2019/03/24(日) 09:19:14: これね。
>>
一言居士さん、
一般人の理解では、難しく考えすぎない方が良いと思います。論文というのは、専門家以外の人でも興味を持ってくれることを目指します。科学は皆のものです。

研究者のなかには、⚪️さんのように、足元がら一般人を侮辱するタイプの人がいますが、この戦法にめげないようにしましょう。

記事で示したメッセンジャーＲＮＡ図の色つき状態を見れば、ESとSTAPの相違は明らかです。

この時期の小保方氏は、STAP細胞は用意できただけかな？と思います。幹細胞実験には小保方氏は参加しておらず、若山氏から譲られた細胞しか持ち合わせていないのではないか？と想像します。

GRASから再度、サンプル提出を要請されても、小保方氏に混乱があり、しかるべきサンプルを用意できなかたのではないでしょうか？
2019/3/22(金) 午前 8:51返信する
346：一言居士：2019/03/24(日) 09:29:37: >>学さん

>この時期の小保方氏は、STAP細胞は用意できただけかな？と思います。幹細胞実験には小保方氏は参加しておらず、若山氏から譲られた細胞しか持ち合わせていないのではないか？と想像します。

大まかにそういうことだと思います。ただし、STAP細胞を作らされているということは
その都度どんなマウスを渡されているかはわかっています。GRASへの解析依頼に関しては
基本長である若山さんの依頼認可が必要ですから若山さんの指示で行っていて、この手伝いを
詳しい先輩(共著者の野老博士さんだと思います)が手伝ってくれたと手記では説明されています。
従って小保方さんが全く関与していないということはないですね。ただ、笹井研に移ってからの
分析は小保方さんが行っていて、このヒートマップは同じく共著者の門田さんの仕事ですね。
笹井さんがかわいがっていた人のようです。
347：一言居士：2019/03/24(日) 09:38:06: >GRASから再度、サンプル提出を要請されても、小保方氏に混乱があり、しかるべきサンプルを用意できなかたのではないでしょうか？

GRASからの再度サンプル提出要請はないです。彼らは提出されたものを分析するだけです。
再提出しているのは笹井さんや小保方さんです。樹上図がうまく理屈どうりにならなかったからですね。
丹羽さんのCD1のTSは若山さんの作ったTSが分化していたらしいという理由で、
提供されたものです。これは報告書に書かれています。ところが遠藤さんが分析した二つのTSラインは
B6と129のF1だという結果になっている。でも登録はTSは全部CD1になっています。
Ts.Marker の分析の記事のところにも書きましたが、この登録事務時にも何か混乱が
あるようだと推測しています。というのもあまりに矛盾が多いんです。
348：一言居士：2019/03/24(日) 09:40:01: Ts.Marker の→Ts.Marker さんの
349：一言居士：2019/03/24(日) 09:52:36: で、肝心のヒートマップですが、まず最初のaはSTAP細胞の全RNA発現遺伝子ですね。それに対して
ESとSTAP-SCとTSとFI-SCの同じ遺伝子発現がどうかと比較されている。STAP細胞が基準ですから
このときのSTAP細胞に例えばSox21が発現していなければ、他の細胞には発現していても項目には上がりません。
そういう比較ですね。bは同様にES細胞基準です。
二つの問題があると思いますね。
①酸浴されているのはSTAP細胞だけで、GRAPDH値が他と違う。
②時々の細胞の状態によって発現RNAが変わる可能性。特にSTAP細胞はまだ確かな幹細胞であると確定していない。
350：一言居士：2019/03/24(日) 09:57:43: ①は相沢論文に論じられていることです。ハウスキーピング遺伝子が動いたら比較はできません。
②はキメラができたとされているから笹井さんたちが油断したんで、これがまだ
博論段階の研究だったら、こんな分析は何も言えてることになりません。でも、
キメラはできていて、STAP細胞は幹細胞だと、小保方さんは言うに及ばず、笹井さん、
丹羽さんも含めて若山さん以外の関係者全員が信じているんです。
事件は単相ではありません。以上です。
351：小野小町：2019/03/24(日) 10:17:17: 貼ってらっしゃいな。
352：一言居士：2019/03/24(日) 10:18:08: 今、作業中みたい。
353：一言居士：2019/03/24(日) 17:33:38: まだ書き込めないね。それと前回分の丹羽論文に関するコメントがまだ反映されてない。
354：小野小町：2019/03/24(日) 17:36:23: Lさんの返信がきてるけど、最初の投稿の[連投1]がさっきあがったばかりね。
何か変調みたいね。しばらく様子見しましょ。それより事務さんに送る原稿が
本来の私たちの検討よね。
355：小野小町：2019/03/24(日) 17:37:04: 事務さん→ジムさん
356：閲覧者：2019/03/24(日) 17:38:57: そこまで考えてる人は少ないみたいだね。でも、人の発想は何か参考になるはずだからね。
もう少し待とう。その間、自分たちは自分たちで考えていたらいいでしょ。
357：ヘーゲル：2019/03/24(日) 17:39:32: 本題頼むぜ。
358：カール・ヤスパース：2019/03/24(日) 17:40:17: 本題、何でしたっけ?
359：デラ・ストリート：2019/03/24(日) 17:47:50: 酸浴細胞の問題点ね。ハウスキーピング遺伝子の不安定化の問題。Oct4遺伝子プロモーターによる
GFP発現制御設計に対する酸浴の影響。
360：一言居士：2019/03/24(日) 19:46:54: なんか、あそこだけ変みたいだな。他の場所には送れた。これで全部送って
アップされていないのが2件で待ちだね。
361：地球の上に朝が来た、その裏側は夜だろう。：2019/03/25(月) 05:35:29: 😭　😃　😵　😒　😣　😝　😍　😆　😔　😳　😉　😴　🙄　🤔　😕　😡　😱　👿　
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362：在原業平：2019/03/25(月) 05:36:21: モーニン、小町ちゃん。コーヒーね。
363：小野小町：2019/03/25(月) 06:27:00: 学さんが丹羽論文に関してはアップしてくれたわ。ご自分で納得してから
アップされているみたいね。もう一つはまだよ。
364：在原業平：2019/03/25(月) 06:29:10: それは真摯に対応していただけるようになったという意味ではむしろありがたいね。
問題提起した甲斐があったという結果になることを望んでる。
>>

丹羽氏は、ＧＯＦマウス由来の細胞を使うと、酸浴後、自己発光してしまい、緑と赤の両方の蛍光を出すが、7日培養細胞において、ｍＲＮＡが発現しているのを確認できるとしています。つまり、Ｏｃｔ挿入遺伝子の影響で赤も緑も蛍光が出ている（挿入遺伝子が洩れる）ものの、ｍＲＮＡができている（Ｏｃｔ遺伝子が機能している）という意味だと思います。

ＧＯＦマウスでないマウス由来肝細胞を酸浴して得た細胞凝集塊では自家発光はせず、ＯｃｔｍＲＮＡと、蛋白産生が見れています。

ただし、Oct陽性細胞の割合は、HCl酸浴肝細胞と酸浴させていない肝細胞と同程度であり、肝細胞にはそうした細胞が含まれるか、あるいは非特異的な検査結果か？とのことのようです。

つまり、ＡＴＰ酸浴後幹細胞において、細胞は初期化遺伝子を働かせたということです。
2019/3/24(日) 午後 7:12返信する
365：一言居士：2019/03/25(月) 06:42:38: 自家蛍光はいろんなスペクトルを出すので、緑色フィルターだけで見るのではなくて
赤色フィルターでも見る。因みにライブセルイメージングでは同時に多画面を見れるんで
緑も赤も同時に確認されたら自家蛍光が混じってることだけはわかるんだよね。
このときは緑色が本当に挿入遺伝子の蛍光であるかどうかは別の手段で確認する
ことになるんだけど、人工遺伝子の存在をPCRで確認する方法や、マーカー識別しようと
している目的のmRNA自体の存在をPCRで確認する方法、そして目的のmRNAの発現結果である
タンパク質の存在を免染確認する方法とあるね。丹羽さんは無論全部確認している。
366：閲覧者：2019/03/25(月) 06:53:53: 自家蛍光なんて蛍光顕微鏡を見るときの初歩知識だよね。もともとこんなことを
言い出したのがノフラーと関さんだったね。これって小学生レベルの話なんでしょ。
367：在原業平：2019/03/25(月) 06:56:47: 若山さんの人脈さ。誰かさんのハアイ、ポールで分かるじゃないか。
368：小野小町：2019/03/25(月) 06:58:04: Ts.Markerさんの質問はガン無視ね。
369：一言居士：2019/03/25(月) 07:00:59: ははは、今はそういう話じゃないの。
>>
ＧＯＦマウスでないマウス由来肝細胞を酸浴して得た細胞凝集塊では自家発光はせず、ＯｃｔｍＲＮＡと、蛋白産生が見れています。

ここは自家蛍光もあったかどうかは確認写真がないよね。ただ、自家蛍光の無いものを使っているということでしょ。
アルブクレマウスで幹細胞由来細胞だとはっきりわかっているものだよね。
370：閲覧者：2019/03/25(月) 07:03:44: ここは学さんブログに来てよかったところだね。我々は以前Figure 4-aのGFPを
Oct4-GFPと思い違いしてたからね。よく見るとアルプクレと書いてある。
371：一言居士：2019/03/25(月) 07:32:08: Figure 3はGOFマウスを使っていて、Figure4はAlb-cre/Rosa-GFP Tg miceだと書かれている。
>>
ただし、Oct陽性細胞の割合は、HCl酸浴肝細胞と酸浴させていない肝細胞と同程度であり、肝細胞にはそうした細胞が含まれるか、あるいは非特異的な検査結果か？とのことのようです。

これはGOFマウスの結果でFigure3-aのことだと思われるけど、コントロールのES細胞では
CAG-GFP遺伝子と内在性Oct4遺伝子の発現量がそれぞれ1に設定してあって、赤と緑の棒グラフで示されている。
それに対して、肝細胞を乖離した時点で既にGFPが7/100程度発現している。ATP処理しても8/100程度、
HCL処理すると1/10に近いという結果だね。それに対する内在性Oct4遺伝子の発現は検出限界のゼロだ。
つまりGFPは光ってるが肝心の内在性Oct4遺伝子の発現は無いよと言ってるんだね。
372：小野小町：2019/03/25(月) 07:33:32: 自家蛍光とは無関係なのね。
373：在原業平：2019/03/25(月) 07:40:29: これはqPCRの検証でmRNAそのものを検出している。光ではないから関係ない。
Oct4-GFP遺伝子は発現しているがOct4遺伝子そのものは発現してないという結果だ。
丹羽さんはそのGFPの発現をleaky expressionと言ってるが、原因には触れていない。
コントロールのESのGFPはCAG-GFPだ。なぜOct4-GFPにしなかったのかという問題だね。
そして、ES細胞を酸浴させるとそのOct4-GFPの発現がどうなるかをどうして
確認しなかったか。
374：小野小町：2019/03/25(月) 07:43:49: 理研の予算を使って特許申請維持できるのかということを確認するための実験なので
Oct4-GFP人工遺伝子の設計が酸浴に対してどうであるかということを研究するのが
目的ではないということね。そんなこと始めてたら検証は延々終わらないことに
なってしまうのね。
375：一言居士：2019/03/25(月) 07:45:32: そういうことだね。で、では小保方さんがハーヴァード以来追い求めてきた細胞は
GFPの漏れ出しに過ぎなかったのか?
376：閲覧者：2019/03/25(月) 07:47:35: そんなバカな話はないね。ハーバードと東京女子医大時代に小保方さんは
GFPなんて使っていない。qPCR検証だ。
377：一言居士：2019/03/25(月) 07:54:19: Figure3-aはコントロールがES細胞だ。丹羽さんは酸浴スフィア塊から内在性Oct4遺伝子が
発現しているとしたらとても微量だと気付いたので、今度はFigure3-bでコントロールを
ES10個分にしたのさ。そしたら引っかかってきたんだよ。途轍もなく微量だったということだ。
一回の実験で50万個の肝細胞を使って最大ES細胞換算で12個分の発現量しかなかった。
378：小野小町：2019/03/25(月) 07:56:52: その12個分の発現量は12個に集まっているかどうかは分からないのね。たくさんの数の
細胞に微量に分散しているものの総体であるかもしれない。
379：一言居士：2019/03/25(月) 08:02:42: そうだ。しかし、一個でもその一個にES細胞1個分の発現量のあるものが存在していると
大量に実験すると三胚葉に分化誘導できるシャーレが出現するかもしれない。50万個の細胞から
丹羽さんはスフィア塊を20から30個作れている。小保方さんはその一回30万個の実験を
何十回も行って、ついに三胚葉分化を確認してるんでしょ。それが今あるティシュー論文で
ヴァカンティが今もなお特許申請継続しているものさ。
380：小野小町：2019/03/25(月) 08:03:52: こんな微量な細胞でキメラがあんなに高い確率でできてくるわけがないのね。
381：在原業平：2019/03/25(月) 08:08:11: キメラは若山さんのいたずらだ。ただそんないたずらを可能にしたのは丹羽さんが
見つけたGFPの漏れ出しだ。原因は分からないが、これを何物かだと若山さんも
思い込んだんだ。小保方さんも今までの細胞とは違って大量にできてきていると
思いこんでいるのさ。だから騙され続けた。
382：小野小町：2019/03/25(月) 08:09:54: 二人とも共通にGFP蛍光のアーティファクトに騙されていたのね。
383：一言居士：2019/03/25(月) 08:14:27: 若山さんはよく光ってはいるけどこの細胞からキメラはできないと知っている。
自分がキメラ実験しているからね。ただ、光っていることが内在性Oct4発現と
対応していると信じ込んでいる。丹羽さんの検証実験はまだ行われていないんだからね。
若山さんはこの細胞の核をクローン胚に入れてみたかったんだよ。そして実際に
それを行ってキメラと幹細胞を作った。その時に小保方さんを山梨大にリクルートしたいという
別の事情と重なって、一時的な嘘をついたんだよ。その因果がここまで事件を
引っ張ってきたのさ。
384：閲覧者：2019/03/25(月) 08:23:10: >>
つまり、ＡＴＰ酸浴後幹細胞において、細胞は初期化遺伝子を働かせたということです。

ここはその通りだよね。
385：デラ・ストリート：2019/03/25(月) 08:24:13: はい、続きよ。
>>
つまり、酸浴刺激により細胞は変化することが確認されているわけです。また、動物体内には初期化能をもつ細胞の待機があり、需要に応じて変幻自在に変化するはずですから、初期化機能を持つ細胞がその先の細胞へ分化したり、あるいは元へと戻ったりと、細胞は異変克服へと進むはずです。病気の臓器を修復させる方向へ進むはずです、

ＴＳさんの解析でも明らかなように、ＳＴＡＰ細胞は、従来の遺伝子制御とは異なる細胞です。

すなわち、ＳＴＡＰ細胞の遺伝子発現は、“従来と違う”顔つきです。ＳＴＡＰ実験中にそうした細胞が存在していたのですから、小保方氏は遺伝子発現の一風変わった細胞を作製した事は確かなことです。若山氏もその機能に興味を持ち追及しました。

しかし、その実験でつかった細胞にアクロシンが入っている事を知らずに、小保方氏は論文執筆をしてしまったということです。
2019/3/24(日) 午後 7:38返信する
386：一言居士：2019/03/25(月) 08:43:30: >>
ＴＳさんの解析でも明らかなように、ＳＴＡＰ細胞は、従来の遺伝子制御とは異なる細胞です。

①ハーヴァード以来の小保方細胞
②理研での酸浴細胞
③若山さんの曰くつきいたずらキメラと幹細胞

三つを分けて考えるべきだね。
387：デラ・ストリート：2019/03/25(月) 08:45:06: つづきよ。
>>

> 一言居士さん
ExtFig4aの蛍光図は、肝細胞であることをしめす緑色蛍光です。・・・the cell aggregates were derived from 8-days old of Alb-cre/Rosa-GFP Tg mice.

凝集塊は1０個位の細胞数にみえますけど、この位の数以下でないと胚には入らないような気がします。

スフィア塊は、写真からみると大きいものから小さいものまで、かなり幅があります。
2019/3/24(日) 午後 7:50返信する
388：一言居士：2019/03/25(月) 09:00:27: ここはExtFig4aでなくて丹羽論文のFig4aのGFP蛍光のことだよね。これは僕は
以前からOct4-GFPだと勘違いしてたからね。とてもありがたい指摘だった。3個目の
スフィア塊にOct4蛋白染色がないのにGFPが光っているのを漏れ出しの原因だと思ってた。
ただ、スフィア塊は基本ほぼ1000個だよ。ブライトフィールドを見たら10個以上じゃないか。
あれはパラフィン固定してスライスした断面だけど、球の体積は4πr^3/3なんで
半径に6個見えたら959個だ。それに上は桑実胚なので16個だけど下は胚じゃなくてスフィア塊だ。
389：小野小町：2019/03/25(月) 09:47:15: ティシュー論文の記述ね。
>>
Individual spheres possessed >2000 cells.
(The Potential of Stem Cells in Adult Tissues Representative of the Three Germ Layers:Sept.2010)
390：在原業平：2019/03/25(月) 09:52:43: 学さんのところは最後の連投5がまだ残ってるね。以上ですの稿だ。
391：小野小町：2019/03/25(月) 09:53:34: 今日の原稿は一日待った方がいいかしらね。
392：一言居士：2019/03/25(月) 09:54:23: では今日の返事を準備しよう。
393：一言居士：2019/03/25(月) 12:01:07: 原稿できたぞ。

[連投1]
>>学さん
自家蛍光はいろんなスペクトルを出すので、緑色フィルターだけで見るのではなくて、赤色フィルターでも見ますね。因みにライブセルイメージングでは同時に多画面を見れるので、緑も赤も同時に確認されたら自家蛍光が混じってることだけはわかりますが、手記にある通り、小保方さんはキメラ成功前から若山研でライブセルイメージング実験をラボメンバーに手伝ってもらって自家蛍光確認も行っています。(86P)
394：一言居士：2019/03/25(月) 12:01:47: [連投2]
実験の都合次第で自家蛍光の無いものだけを取り出すこともできるでしょうし、自家蛍光の混じっている細胞しか観察されず、加えて必要があるなら、緑色蛍光が本当に挿入マーカー遺伝子の蛍光であるかどうかは別の手段で確認できますね。
①挿入人工遺伝子の存在をPCRで確認する方法
②マーカー標的している目的のmRNA自体の存在をPCRで確認する方法
③目的のmRNAの発現結果であるタンパク質の存在を免染確認する方法
丹羽さんは取り混ぜてすべて行っていますね。
395：一言居士：2019/03/25(月) 12:02:20: [連投3]
自家蛍光の存在は蛍光顕微鏡を見るときの初歩知識で、関連の専門家ならだれでも知っています。STAP細胞の緑色蛍光を自家蛍光だと最初にいいだしたのがノフラーさん、日本では関さんですが、若山さんの人脈ですね。ノフラーさんのブログで、誰かさんがハアイ、ポールと呼び掛けて問答があるのですが、対してTs.Markerさんの<やっぱりね>質問はガン無視されていることはご承知のとおりです。
396：一言居士：2019/03/25(月) 12:03:00: [連投4]
>>ＧＯＦマウスでないマウス由来肝細胞を酸浴して得た細胞凝集塊では自家発光はせず、ＯｃｔｍＲＮＡと、蛋白産生が見れています。

ここは自家蛍光もあったかどうかは確認写真がありませんが、ただ、自家蛍光の無いものを使っているということでしょうね。アルブクレマウスですね。僕の勘違いは後で述べます。
397：一言居士：2019/03/25(月) 12:03:30: [連投5]
>>ただし、Oct陽性細胞の割合は、HCl酸浴肝細胞と酸浴させていない肝細胞と同程度であり、肝細胞にはそうした細胞が含まれるか、あるいは非特異的な検査結果か？とのことのようです。

これはFigure3-aのことをおっしゃってるのだと思われますが、コントロールのES細胞ではCAG-GFP遺伝子と内在性Oct4遺伝子の発現量がそれぞれ1に設定してあり、赤と緑の棒グラフで示されていて、それに対して、GOFマウスの肝細胞を乖離した時点で既にOct4-GFPが対数スケールで7%程度発現している。ATP処理しても8%程度、HCL処理すると10%に近いという結果ですが、それに対する内在性Oct4遺伝子の発現は検出限界のゼロです。つまりGFPは光ってるが肝心の内在性Oct4遺伝子の発現はほとんど無いと言ってるわけですね。
398：一言居士：2019/03/25(月) 12:04:15: [連投6]
これはqPCRの検証でmRNAそのものを検出しているのでもちろん自家蛍光の問題なんかとは無関係です。Oct4-GFP人工遺伝子は発現しているが、内在性のOct4蛋白質を作る遺伝子そのものは発現してないという結果ですね。丹羽さんはそのGFPの異常発現をleaky expressionと言ってますが、原因には触れていませんね。
Oct4-GFPの設計は内在性のOct4遺伝子を動かすためのプロモーターと同じものをGFP製造プログラムにつなげていますから、一方が動き出したら他方も動く仕込みです。でも生体の中でのことですから、酸浴亜致死下では双方の発現がどうなるかまでは考えられていませんよね。
399：一言居士：2019/03/25(月) 12:04:58: [連投7]
またコントロールのESのGFPはCAG-GFPです。なぜOct4-GFPマウスのESを使わなかったのか、そして、ES細胞を酸浴させるとそのOct4-GFPの発現がどうなるかをどうして確認しなかったのかという問題もありますが、理研の予算を使って特許申請維持できるのかということを確認するための実験をしているわけですから、Oct4-GFP人工遺遺伝子の設計が酸浴などという非常識な条件下に対してどうであるかということを研究するのが目的ではないわけですよね。そんなこと始めてたら検証は延々終わらないことになります。
400：一言居士：2019/03/25(月) 12:05:53: [連投8]
では、理研に来る前に小保方さんが追及していた細胞は何であったのかというと、無論、ハーバードと東京女子医大時代に小保方さんはGFPなんて使っていません。qPCR検証です。丹羽さんはFigure3-aの実験で、酸浴スフィア塊から内在性Oct4遺伝子が発現しているとしたらとても微量だと気付いたので、今度はFigure3-bでコントロールをES10個分にしました。その結果が小保方さんが理研に来る前から追いかけていた細胞のようですよね。
401：一言居士：2019/03/25(月) 12:07:50: [連投9]
丹羽さんの検証では一回の実験で50万個の肝細胞を使って最大ES細胞換算で12個分の発現量しかなかった。その12個分の発現量は12個に集まっているかどうかすら分からない。たくさんの数の細胞に微量に分散しているものの総体であるかもしれない。しかし、その一個にES細胞1個分の発現量のある酸浴細胞が1個でも存在していると大量に実験すると三胚葉に分化誘導できるシャーレが出現するかもしれない。50万個の細胞から丹羽さんはスフィア塊を20から30個作れている。小保方さんはその一回30万個の実験を何十回も行って何百個のスフィア塊を使って、ついに三胚葉分化を確認してるんでしょ。(手記53P)それが今あるティシュー論文でヴァカンティが今もなお特許申請継続している実験結果です。
402：一言居士：2019/03/25(月) 12:08:43: [連投10]
物理刺激と酸浴刺激の違いはあるが、小保方細胞の出現経過は共通しているのではないでしょうかね。無論、こんな微量な細胞でキメラがネイチャー論文のようなあんなに高い確率でできてくるわけがありません。キメラは若山さんの曰くつきの"いたずら"です。ただ、その曰くはともかくとして、そんないたずらが可能であったのは丹羽さんが見つけたGFPの漏れ出し現象があったからです。原因は分からないが、これを何物かだと若山さんも思い込んだ。小保方さんも今までの細胞とは違って大量にできてきていると思いこんでいるんです。だから騙され続けた。二人とも共通にGFP蛍光のアーティファクトに騙されていたんです。
403：一言居士：2019/03/25(月) 12:09:37: [連投11]
若山さんはよく光ってはいるけどこの細胞からキメラはできないと知っている。自分がキメラ実験してますからね。ただ、GFPの光っていることが内在性Oct4発現と対応していると信じ込んでいる。丹羽さんの検証実験はまだ行われていません。若山さんはこの細胞の核をクローン胚に入れてみたかったんですよ。それはいたずらなんかじゃない。正真正銘の科学者の好奇心ではないですか。そして実際にそれを行ってキメラと幹細胞を作ったが、その時に小保方さんを山梨大にリクルートしたいという別の事情と重なって、一時的な嘘をついたんです。その因果がここまで事件を引っ張ってきたのだとみています。
404：一言居士：2019/03/25(月) 12:11:56: [連投12]
>>つまり、ＡＴＰ酸浴後肝細胞において、細胞は初期化遺伝子を働かせたということです。
>>ＴＳさんの解析でも明らかなように、ＳＴＡＰ細胞は、従来の遺伝子制御とは異なる細胞です。

その通りだと思います。いや、ハーヴァード時代からその意味では彼女の細胞は本物です。

①ハーヴァード以来の小保方細胞
②理研での酸浴細胞
③若山さんの曰くつき"いたずら"キメラと幹細胞

三つを分けて考えるべきだと思っているんです。
405：一言居士：2019/03/25(月) 12:12:33: [連投13]
>>ExtFig4aの蛍光図は、肝細胞であることをしめす緑色蛍光です。・・・the cell aggregates were derived from 8-days old of Alb-cre/Rosa-GFP Tg mice.

ご指摘有難うございます。僕は以前からOct4-GFPだと勘違いしてました。3個目のスフィア塊にOct4蛋白染色がないのにGFPが光っているのを漏れ出し原因だと思ってました。ただExtFig4aはFig4aですね。
406：一言居士：2019/03/25(月) 12:15:48: [連投14]
>>凝集塊は1０個位の細胞数にみえますけど、この位の数以下でないと胚には入らないような気がします。スフィア塊は、写真からみると大きいものから小さいものまで、かなり幅があります。

ティシュー論文に「Individual spheres possessed >2000 cells.(The Potential of Stem Cells in Adult Tissues Representative of the Three Germ Layers:Sept.2010)」とあります。STAP論文にもどこかにあったと思いますけど今見つけられません。いずれにせよ、勘違いなさっておられるので、図のブライトフィールドの三番目のスフィア塊の直径上に並んでいる細胞数を数えてみてください。12個程度でしょ。半径が6個のスフィアの体積は4πr^3/3で959個程度と逆残できます。写真はパラフィン固定して薄くスライスした中央付近の断面です。上は桑実胚なので16細胞期ですが、下は胚じゃなくてスフィア塊です。若山さんがナイフで切り分けてインジェクトするあれです。以上です。
407：一言居士：2019/03/25(月) 12:17:15: 959→904
408：小野小町：2019/03/25(月) 12:25:56: 投稿してらっしゃいよ。
409：一言居士：2019/03/25(月) 12:27:22: [連投6]まで送れたけど、また不調だ。しばらく休もう。なんか変だよ。
410：地球の上に朝が来た、その裏側は夜だろう。：2019/03/26(火) 05:51:53: 😭　😃　😵　😒　😣　😝　😍　😆　😔　😳　😉　😴　🙄　🤔　😕　😡　😱　👿　
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411：在原業平：2019/03/26(火) 05:52:43: モーニン、小町ちゃん。コーヒーね。
412：小野小町：2019/03/26(火) 06:09:21: 学さんは送ったのは全部アップしてくれてるわね。
413：一言居士：2019/03/26(火) 06:11:27: 最新の記事の場所に残りを全部送ったよ。ヤフーがおかしいみたいだね。
それともハッカーかな。こっちが原因かあっちが原因かもわからないね。
414：小野小町：2019/03/26(火) 06:12:49: ヤフーブログはでも所詮終了するんでしょ。
415：一言居士：2019/03/26(火) 06:16:49: いずれにせよなんかこれといった反論もないね。一番まともに答えてくれてるのは
学さんだよ。
416：閲覧者：2019/03/26(火) 06:19:44: Figure4がアルブクレマウスだと注意してくれたのはありがたかったな。
417：小野小町：2019/03/26(火) 07:12:24: 今確認に行ったらあのねさんの3/25と3/26のコメントがあったわ。深いところなんで
分からないわね。それといくつか質問を見落としている。
418：デラ・ストリート：2019/03/26(火) 07:15:24: まずこれね。
>>
> 一言居士さん

急いではいませんが、非リンパ球仮説の説明は待っています。でも、この問題も並行して教えていただけませんか。私も興味があります。できたらレター論文のヒートマップの解釈もお聞かせ願いたい。横からですみません。以上です。

もう少し待ってください。私が論理を展開に至った理由は自分なりの科学に対する考え方のスタンスがあります。他の方には荒唐無稽と思われがちですが…
遺伝子解析について手記「あの日」では、ChIP-seq解析を要求されたとか、リバイス後の解析に細胞の種類を集められなかったとの記述がありますがこの辺の解析とは何を指すのか把握できていません。良かったら教えてください。
2019/3/22(金) 午前 6:02[ あのね ]返信する
419：ペリー・メイスン：2019/03/26(火) 07:21:37: これはどこにあるのかわからないけどな。
>>
若山研の常套手段、リプログラミング改善補助のTSA。
本命でなくとも、いい線行くと思うんだが。
2019/3/26(火) 午前 0:06 [ Ts.Marker ] 返信する
420：デラ・ストリート：2019/03/26(火) 07:22:53: あとは全部学さんが最新の記事にまとめてくれてるわね。
421：一言居士：2019/03/26(火) 07:32:13: 書き込みに気づいてなかったね。

>遺伝子解析について手記「あの日」では、ChIP-seq解析を要求されたとか、リバイス後の解析に細胞の種類を集められなかったとの記述がありますがこの辺の解析とは何を指すのか把握できていません。良かったら教えてください。

127Pのことだろうね。
422：地球の上に朝が来た、その裏側は夜だろう。：2019/03/27(水) 03:09:13: 😭　😃　😵　😒　😣　😝　😍　😆　😔　😳　😉　😴　🙄　🤔　😕　😡　😱　👿　
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🎶　🎵　🎧　🔈　🔉 　🔊　📀　📞　🔫　🚓　🍸　☕　🍰　🍶　🍻　📡　🔑　🌈　
📖　🆖　⏫　⏬　❎　🆘　🅿　🆗　⏪　🔙　🔜　💸　💐　🚨　📠　🏣　🏢　🚢　
🏦　🏭　⛵　🚇　⚾　⚽　🏈　🎿　🎆　🍀　🏊　♨　🎲　🎌　🎳　🎢　🌁　🌟　
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423：在原業平：2019/03/27(水) 03:10:06: モーニン、小町ちゃん。コーヒーね。
424：小野小町：2019/03/27(水) 03:11:19: 昨日送ってまた障害でストップして分を学さんがアップしてくれてるわね。
425：一言居士：2019/03/27(水) 03:14:11: そこに今送ろうとしたら止められてる。多分学さんのブログに誰か入り込んでいたずらしているね。
僕のパソコンからのを止めてるんだよ。連投が原因でないのは最初の障害で分かってる。これで
4回目だ。
426：在原業平：2019/03/27(水) 03:18:20: まあ、あのねさんにデータを送ろうとしただけだからいいんだけど、学さんが
察して新たな記事を立ち上げてくれたんだろうけど、だめだね。誰かがあそこに書き込めばわかるが、
我々が止められたところからは誰も書き込めてない。もう一度、以前の記事のところに書き込んで
みようかな。学さんは気づくだろ。

ペーパー一枚への道 その1