HEK293Tでのルシフェラーゼアッセイについて - 1279677368

1：JH：2010/07/21(水) 10:56:08: はじめまして、JHと申します。
質問があって書き込ませていただきます。

HEK293TにNF-kBレポータ遺伝子と各種TLR、NLRs遺伝子を導入し、TKプロモータレポータ遺伝子を
標準化用に導入して、細菌による刺激を調べようとしています。

ところが、どうしてもリガンドを接触させていないサンプルで、NF-kB活性が起きてしまいます。(起きないときもありますが)
HEK293Tに使用している培地やアッセイ試薬にリガンドがコンタミしていることはなさそうです。
なぜかTLR5とTLR9ではうまくいきますが・・・
(NF-kBレポータ遺伝子を安定発現させたRAW264細胞で、テストしました。）

また、HEK293Tのアッセイで使用しているコラーゲンコートの24well plateで、コラーゲンが認識されているのではと考え、
そちらでもRAW264によるテストを行っています。

みずほさんの経験上、このような現象がなぜ起きるか教えてくだされば光栄です。
2：みずほ：2010/07/22(木) 01:41:24: リガンドを接触させていないサンプル･･･、というのはTLRs,NLRsを発現させた細胞が発現させなかった細胞にくらべてNF-ｋBの活性化が起きるということですか？
そうでしたら、それはむしろ普通です。TLRsやNLRsを過剰発現させればリガンドがなくてもNF-ｋB活性化がおきます。
リガンドを加えればさらにNF-ｋBの活性化が起こるはずですが、ただ、過剰発現させすぎるとリガンドによるinductionは見にくくなります。
とはいっても、発現が低すぎても活性化が弱くなります。
だから細菌の刺激活性を調べたいのであれば、まずは精製リガンドを使っていちばんinductionが見やすい条件を、TLRsやNLRsの導入量をふって検討してみる必要があります。
3：JH：2010/08/02(月) 09:45:58: みずほさん
どうも親切にありがとうございます！
今みずほさんに指摘していただいた条件検討を行っています。
またうまくいったら書き込みします。
4：GN：2010/08/10(火) 06:52:39: googleで偶然こちらを見かけまして、良かったら教えてください。
293でNLRやNLRのレポーターアッセイした際、fold inductionで表している図と、元のluminescenceの値で表している図を見かけます。
単純にluminescenceの値を比較せず、、fold inductionで比較しているのは、サンプルごとにベースラインが違ってしまうい、揃わないからなのでしょうか？
5：みずほ：2010/08/20(金) 03:33:36: GNさん、気づくのが遅くなってすいません。
用は示し方が相対値か、絶対値かですよね。luminescenceの値は、試薬でも機械でも違いますから、値そのものはまったく意味がありません。だからluminescenceの値で示されていても、結局見るのは相対ですよね。
それに同じ操作をしても導入効率やちょっとしたことでluminescenceの値は変わってきますから、複数の実験間で比較するのにも絶対値は向いていないです。
だから、結果はどちらで示しても同じだけれども、どれだけ応答性があるのかというのを示したいのであれば、fold inductionのほうがよりclearで見やすいのではないでしょうか。
6：某M：2010/08/21(土) 02:45:14: プラスミド自体が大腸菌から精製しているので非メチル化CpGを含んでいるから
Nf-kBを活性化するんでは。ステイブルではメチル化を受けているから活性化しないのでは。
以前プラスミドをメチラーゼ処理した後入れたらNF-ｋBの活性化が抑えられました。
まあ修士の時やった実験なんで理屈が正しいか保証できませんがｗ
7：みずほ：2010/08/21(土) 12:00:52: 某M君。もし非メチル化CpGの問題だとしたら、何かそれを認識してNF-ｋBを活性化するようなものがもともと293に存在するということだよね？
8：某M：2010/08/23(月) 14:08:49: そこなんですよ。293にはNLRやTLR的なものはないようなので不思議だったんです。
証拠がなく現象だけで論じてしまい申し訳ないです。
InvivogenでCpGの影響をなくすような精製キットが売ってたと思うんでやってみますかね。
9：みずほ：2010/08/25(水) 08:50:09: 余裕があれば、つめてみたらどうですか？発見あるかも！？
10：JH：2011/02/05(土) 17:39:19: お久しぶりです。

あの後、みずほさんに言われたように、DNA量を調整した結果、だいたいのHEK293のTLRs
アッセイ系は、うまくいきました。

しかし、NOD1,NOD2のアッセイ系は受容体DNA量の調整では、どうしてもうまくいきません。
リン酸カルシウム法でトランスフェクションしています。刺激時間は6時間です。
アゴニストは必要量入れています。同じ方法で、TLRを発現させた系ではうまくいきます。

何か良い解決策があれば、ぜひご教授願います。
11：JH：2011/02/05(土) 20:02:13: ちなみにプラスミドは大腸菌から精製しています。
HEK293にTLR9を発現させた系において、刺激をしていない場合、NF-kBの活性は一切見られません。
某Mさんがおっしゃるような非メチル化CpG配列の影響は受けていないと思います。
12：みずほ：2011/02/06(日) 02:41:51: TLRうまくいってよかったですね。
Nod1,Nod2はプラスミドを変えてみてはどうですか？
うちには何種類かプラスミドがあって、よくわからないですが、リガンド応答性が良いもの、悪いものがあります。
刺激時間は、私はもっと長い（16時間）ですが、それが影響するかは試したことがないのでわかりません。
13：M本：2011/02/11(金) 23:34:27: >>11
それはTLR9のステイブルの系ですか？
14：JH：2011/02/19(土) 19:29:02: M本さん
　いえ、一過的に発現させた系です。
15：M本：2011/05/19(木) 01:17:18: 私の結果とは違いますね。まあ私は直接ｋBのレポーターをやったわけではありません。
LTRをプロモーターに使いました。LTRはCpGのメチル化によって発現抑制が起こります。
非メチル化LTRではｋB非依存的に発現が起こったんで。
16：名無しさん：2014/05/02(金) 10:01:08: TLRとNODのレポーターアッセイは293以外の細胞（例えばMEFやNIH3T3, HeLaなど）でも293と同様にレポーターの誘導は見られますか？
ノックアウトマウス由来のMEFを使いたいのですが、論文で293以外を使っているのを見たことがありません。

ノックアウトの解析はマクロファージなどを単離して刺激し、サイトカイン産生を測定するのが定番のようですが、ノックアウト細胞に何か遺伝子を（過剰）発現させて解析したい場合
MEFのほうがとランションし易いので利用したいのですが、MEFでもアッセイできるかご存知でしたら教えて下さい